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精子DNA吖啶橙熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

本文由 上??茖W儀器有限公司 整理匯編

2018-11-18 10:00 473閱讀次數(shù)

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精子DNA吖啶橙(acridineorange)熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書主要用途精子DNA吖啶橙(acridineorange)熒光檢測試劑是一種旨在使用吖啶橙染料使單鏈和雙鏈DNA呈現(xiàn)不同熒光,確定精子染色質(zhì)質(zhì)量或DNA損傷的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種動物或人體精子細胞以及凍存精子細胞。產(chǎn)品嚴格無菌,即到即用,操作簡便,性能穩(wěn)定,熒光清晰。技術(shù)背景在男科學(Andrology)中,精子(spermatozoa)分析提供了精子生成(spermatogenesis)、精子壽命、以及生育能力的基礎信息。其中精子的活力(vitality)、運動能力(motility)、授精潛力(fertilizingpotential)、膜結(jié)構(gòu)或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性(integrity)、頂體反應(acrosomalreaction)功能的評價是精子分析的重要指標,也是決定人工受孕或體外授精(invitrofertilization;IVF)的重要參數(shù)。精子DNA損傷或染色質(zhì)質(zhì)量是不育癥的主要因素之一。使用陽離子三環(huán)胺熒光染料吖啶橙(Acridineorange;AO)染色技術(shù),是精子染色質(zhì)分析和授精效率評價的Z常用的方法?;谡>蛹毎娜旧|(zhì)完整性和DNA雙鏈特性,作為DNA染色劑之一的吖啶橙與正常非變性DNA,即雙鏈DNA嵌合(intercalate)時,呈現(xiàn)綠色熒光(激發(fā)波長488nm,散發(fā)波長530nm);而與變性DNA,即單鏈DNA結(jié)合時,呈現(xiàn)紅色熒光(激發(fā)波長488nm,散發(fā)波長630nm),以此定量分析精子質(zhì)量或DNA損傷。產(chǎn)品內(nèi)容清理液(ReagentA)毫升固著液(ReagentB)毫升染色液(ReagentC)毫升產(chǎn)品說明書1份保存方式保存清理液(ReagentA)在4℃冰箱里,其余的保存在-20℃冰箱里;染色液(ReagentC)避免光照,有效保證6月用戶自備1.5毫升離心管:用于樣品操作的容器微型臺式離心機:用于樣品操作血細胞計數(shù)器:用于細胞計數(shù)載玻片和蓋玻片:用于精子細胞爬片(共聚焦)熒光顯微鏡:用于觀察染色的精子細胞細胞流式儀:用于分析染色的精子細胞實驗步驟一、細胞流式儀分析1.移取新鮮獲得的1毫升精液(30分鐘至1小時內(nèi))到1.5毫升離心管2.放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為600g3.小心抽去上清液4.加入xx毫升清理液(ReagentA),混勻顆粒群5.在血細胞計數(shù)器上進行精子細胞計數(shù):1×107精子細胞/毫升6.放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為600g7.小心抽去上清液8.重復實驗步驟4至7一次(不包括實驗步驟5)9.加入xx微升染色液(ReagentB),混勻顆粒群10.室溫下孵育10分鐘,避免光照11.放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為600g12.小心抽去上清液13.加入xx毫升清理液(ReagentA),混勻顆粒群14.放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為600g15.小心抽去上清液16.重復實驗步驟13至15一次17.加入xx毫升清理液(ReagentA),混勻顆粒群18.即刻進行細胞流式儀雙通道分析:觀察10000個細胞以上,200細胞/秒;激發(fā)波長200mW,散發(fā)波長16mW激發(fā)波長488nm488nm匹配熒光染料異硫氰酸熒光素(FITC)藻紅蛋白(phycoerythrin;PE)熒光顏色綠色紅色散發(fā)波長530630流式儀通道FL1FL3熒光增強正常精子DNA異常精子DNA19.細胞流式儀檢測正常精子DNA(雙鏈DNA)參考圖像如下(X軸:FL3;Y軸:FL1;R1左下角為細胞碎屑;R2為正常精子細胞;R3為異常精子細胞;R4為未成熟精子細胞)二、熒光顯微鏡分析1.移取新鮮獲得的1毫升精液(30分鐘至1小時內(nèi))到1.5毫升離心管2.放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為600g3.小心抽去上清液4.加入xx毫升清理液(ReagentA),混勻顆粒群5.在血細胞計數(shù)器上進行精子細胞計數(shù):1×107精子細胞/毫升6.放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為600g7.小心抽去上清液8.重復實驗步驟4至7一次(不包括實驗步驟5)9.加入xx毫升清理液(ReagentA),混勻顆粒群10.即刻移取20微升到潔凈的載玻片一端11.用蓋玻片或另一個載玻片推片12.置于空氣中涼干13.加上xx微升固著液(ReagentB),覆蓋樣品表面14.室溫下孵育2小時15.小心抽去固著液16.小心加上xx微升染色液(ReagentC),覆蓋樣品表面17.室溫下孵育5分鐘,避免光照18.小心抽去染色液19.小心加上xx微升清理液(ReagentA),覆蓋樣品表面20.小心抽去清理液21.蓋上蓋玻片22.即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)(注意:每個視野計數(shù)200個精子)23.分析結(jié)果(參考圖)觀察紅色熒光:濾波器激發(fā)波長488nm,散發(fā)波長630nm――可見黃色、桔紅色至紅色熒光,表明精子DNA損傷包括單鏈DNA觀察綠色熒光:濾波器激發(fā)波長490nm,散發(fā)波長530nm――可見綠色熒光,表明精子DNA正常注意事項1.本產(chǎn)品為50次操作2.操作時須戴手套3.樣品檢測前,建議在血細胞計數(shù)器上進行精子細胞計數(shù)4.精子細胞計數(shù)時乘上稀釋倍數(shù)104。標準血細胞計數(shù)器(Hemocytometer)的計算方法是:1毫米方塊的細胞計數(shù)X104(稀釋倍數(shù))=實際細胞數(shù)/毫升5.染色完成后,即刻進行檢測分析,否則由于其毒性導致精子DNA異常6.如果流式細胞儀出現(xiàn)干擾,建議使用630nm散發(fā)波長,或進行補償處理,建議使用誘導處理樣品:10單位DNaseI/毫升37℃孵育10分鐘或直接70℃孵育30分鐘7.本產(chǎn)品常用于凍存精子細胞的檢測分析8.本產(chǎn)品可以用于精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(SpermChromatinStructureAssay;SCSA),分析參數(shù)如下:%DFI%HDS名詞解釋DNA斷裂指數(shù)DNAFragmentationIndexDNA著色程度HighDNAStainability相同命名COMPαtHIGRN計算方法紅色熒光:紅色+綠色熒光之比高亮綠色熒光參考值正常人:小于15%正常人:小于10%閾值:小于30%閾值:小于15%高生育力:0-15%中等生育力:16-27%低或差生育力:27-30%參數(shù)意義DNA損傷程度精子成熟程度9.本公司提供系列發(fā)育生物學相關(guān)檢測試劑產(chǎn)品質(zhì)量標準1.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定2.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

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