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病毒基因組提取試劑盒(DNA)說明書
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本文由 耶拿分析儀器(北京)有限公司 整理匯編
2016-05-25 00:00 716閱讀次數(shù)
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病毒基因組提取試劑盒(DNA)說明書
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- 基因組DNA文庫構(gòu)建必備實驗技巧基因組DNA文庫用途十分廣泛,如用于人類及動植物基因組學研究,基因表達調(diào)控研究,分析、分離特定的基因片段等.通常情況下,基因組文庫構(gòu)建的基本流程可以歸為四大步驟:分離基因組DNA、對基因組DNA作相關(guān)的處理、將基因組DNA片段連接入載體、將重組載體轉(zhuǎn)入宿主細胞.一、分離基因組DNA(gDNA)毫無疑問,高質(zhì)量的基因組DNA對于基因組文庫構(gòu)建是至關(guān)重要的.需要通過經(jīng)驗來選擇合適的基因組DNA分離方法,在分離過程中保證DNA不被過度剪切或降解,同時也要盡量保證DNA的純度.二、處理基因組DNA根據(jù)研究目的,研究者需要選擇合適的載體.不同的載體對基因組DNA的長度有不同的要求,必須選擇合適長度的基因組DNA來構(gòu)建基因組文庫.比如,對于黏粒載體,合適的片段長度大約為40kb;對于BAC載體,合適的片段長度平均為120kb-300kb.構(gòu)建黏?;蚪MDNA文庫,需要將基因組DNA用注射器抽打來隨機剪切DNA;接著用末端修復酶修復DNA,可以提高DNA連接入載體的效率;然后通過脈沖場電泳或者普通電泳來找到40kb左右的DNA片段,隨后使用膠回收試劑盒回收DNA.構(gòu)建BAC基因組DNA文庫,需要將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶(常用EcoRI、BamHI或者HindIII)來消化基因組DNA,然后通過脈沖場電泳找到合適長度的DNA片段(比如100kb-150kb),隨后透析回收DNA.需要注意:(1)電泳時,要選用合適的DNALadder,以保證電泳后可以準確定位所需分子量的DNA.(2)電泳以后,應盡量縮短用紫外光照射目標DNA的時間,否則會顯著降低克隆效率.(3)回收DNA的時候,應該要避免過度離心,以防止DNA被剪切,降低文庫質(zhì)量.三、載體的選擇目前,常用的基因組文庫載體有黏粒載體、P1噬菌體載體、PAC載體(P1人工染色體)、BAC載體(細菌人工染色體)和YAC載體(酵母人工染色體).選用何種載體可以參考如下幾個因素:1、目標區(qū)域的大?。喝绻蚪M的目標區(qū)域很小(小于50kb),那么可以選擇黏粒載體甚至λ噬菌體載體.利用現(xiàn)有的商品化的黏粒載體、GX率的包裝混合物和合適的大腸桿菌菌株,可以方便的構(gòu)建黏粒載體文庫.如果基因組的目標區(qū)域比較大,那么P1、PAC或者BAC就比較合適了.P1操作比較困難,PAC相對簡便.BAC載體也是很好的選擇,可以利用現(xiàn)有的成熟產(chǎn)品來構(gòu)建BAC文庫,比如商業(yè)化的一系列BAC載體及配套試劑盒.如果目標區(qū)域非常大(大于250kb),那么YAC載體就是了.不過,應用YAC載體來構(gòu)建基因組文庫,操作非常繁瑣困難.表1各種載體的比較載體容量(kb)宿主導入細胞方式黏粒30-45大腸桿菌轉(zhuǎn)導P170-100大腸桿菌轉(zhuǎn)導PAC130-150大腸桿菌電轉(zhuǎn)BAC120-300大腸桿菌電轉(zhuǎn)YAC250-400酵母轉(zhuǎn)化2、篩選文庫的難易程度:黏粒載體一般使用傳統(tǒng)的濾膜影印雜交來篩選,但是這種方法對于構(gòu)建區(qū)域圖譜及疊連群來說既費力又浪費.大容量載體文庫,如P1、PAC、BAC、YAC,以二維陣列保存,既可以用傳統(tǒng)的單拷貝的探針雜交法篩選,又可以用PCR進行多克隆的群體篩選.而且,使用高容量載體構(gòu)建文庫,可以減少染色體步查的步驟.3、載體拷貝數(shù)的考慮:當把大片段DNA片段克隆到高拷貝的載體時,克隆DNA會發(fā)生重組,從而影響克隆序列的保真性和穩(wěn)定性;而單拷貝載體的低產(chǎn)量DNA是高通量分析的瓶頸.對這一矛盾的解決方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM克隆系統(tǒng),CopyControlTM技術(shù)整合了單拷貝載體與多拷貝載體的優(yōu)點.單拷貝載體能提高插入片段的穩(wěn)定性,而且能在誘導劑的作用下,即時擴增出高拷貝數(shù)的克隆而獲得高產(chǎn)量的DNA.四、將基因組DNA片段連接入載體使用連接酶把上述大小合適的DNA片段連接入載體.許多商業(yè)化載體已經(jīng)經(jīng)過預處理,可以直接使用,無需內(nèi)切酶消化及脫磷酸化處理.選用連接快、效率高的連接酶,連接反應體系以100μl為宜.注意:BAC載體連接完以后,需要將連接產(chǎn)物做脫鹽處理,除去連接反應緩沖液里的鹽分.五、將重組載體轉(zhuǎn)入宿主細胞如果構(gòu)建黏粒文庫,需要用包裝蛋白來包裝上述的連接反應產(chǎn)物,測定包裝好的黏??寺〉牡味?然后轉(zhuǎn)染.挑出重組子,鑒定插入片段的大小.如果文庫的大小和質(zhì)量都令人滿意的話,就可以鋪板進行文庫篩選,或者擴增、保存文庫.如果構(gòu)建BAC文庫,應選擇電轉(zhuǎn)法,將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入受體菌,涂板長出克隆.獲得克隆后需要對BAC克隆的大小進行評估,確定文庫大小是否能夠滿足要求.如果文庫大小合適,就可以進行后續(xù)操作了.六、文庫克隆數(shù)的確定基因組DNA文庫需要包含足夠多的克隆,來保證文庫的代表性.一般使用如下的經(jīng)驗公式來確定:N=ln(1-P)/ln(1-f)P是希望得到的覆蓋率,f是插入片段大小與基因組DNA大小的比值,N是所需的克隆數(shù).舉例來說,用BAC載體構(gòu)建人類基因組文庫,人類基因組大小為3x109bp,插入片段大小為100kb,希望覆蓋率99%,那么所需要的BAC克隆數(shù)為N=ln(1-0.99)/ln(1-[106bp/3x109bp])=138,298技術(shù)支持資料:材料緩沖液和溶液-堿裂解液I,4°C50mM葡萄糖25mMTris-Cl(pH8.0)10mMEDTA(pH8.0)配制堿裂解液I約100ml,滅菌,保存在四度.-堿裂解液II,新鮮配置,室溫保存0.2NNaOH(從10N的NaOH新鮮制備)1%(w/v)SDS堿裂解液II應該新鮮配制,室溫保存.-堿裂解液III,4°C5M醋酸鉀,60ml冰醋酸,11.5mlSDW,28.5ml-酒精-70%酒精-異丙醇-酚:氯仿(1:1,v/v)-醋酸鈉(3M,pH5.2)-STE,4°C10mMTris-Cl(pH8.0)0.1MNaCl1mMEDTA(pH8.0)-TE(pH8.0)10mMTris-Cl(pH8.0)10mMEDTA(pH8.0)載體與菌株BAC轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)基和抗生素含12.5μg/ml氯霉素的LB平板和液體培養(yǎng)基酶和緩沖液溶菌酶RNaseA,不含DNase限制性內(nèi)切酶和相應緩沖液核苷酸/寡核苷酸用于脈沖場凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis)的DNA標準參照物凝膠/點樣緩沖液脈沖場凝膠電泳(Pulsed-fieldgels,或者0.5%瓊脂糖凝膠)離心機/轉(zhuǎn)頭/離心管其他37攝氏度搖床1.BACDNA大量提取方案(參考文獻:Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition)此方案適合從500ml的菌液中提取BACDNA,一般可以產(chǎn)生20-25μg純化的DNA.方法1.將50μlBAC轉(zhuǎn)化菌的過夜培養(yǎng)物接種到500ml含12.5μg/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃震蕩(280rpm)培養(yǎng)12到16小時.2.2500g,4℃,離心15min,收集菌體.3.用100ml冰預冷的STE重新懸浮細菌沉淀.按步驟2方法離心收集細菌.4.用24ml含RNase(100μg/ml)的堿性裂解液I溶解細菌.加溶菌酶至終濃度為1mg/ml.5.加入24ml新鮮配置的堿性裂解液II.蓋緊離心瓶蓋,輕輕翻轉(zhuǎn)瓶子數(shù)次,使內(nèi)容物完全混勻,冰裕5min.6.加入24ml冰預冷的堿性裂解液III,蓋緊瓶蓋,輕輕翻轉(zhuǎn)瓶子數(shù)次,使內(nèi)容物完全混勻,置冰上5min.7.15000g,4℃,離心10min,將上清轉(zhuǎn)移到另一離心瓶中,棄沉淀.8.加等體積的酚:氯仿.輕輕翻轉(zhuǎn)離心瓶數(shù)次,混勻.3000g,室溫離心15min.9.將水相移至另一離心瓶中,加入等體積的異丙醇,翻轉(zhuǎn)離心瓶數(shù)次,混勻.10.15,000g,室溫離心15分鐘,回收核酸沉淀.11.棄上清,用20ml70%乙醇漂洗沉淀.12.棄乙醇,風干使乙醇揮發(fā)殆盡.13.小心將BACDNA沉淀溶于0.2mlTE(pH8.0)中.2.BACDNA的小量提?。▍⒖嘉墨I:Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition)此方案適合從5ml菌液中提取BACDNA,一般可以產(chǎn)生0.1-0.4μg的BACDNA.方法:1.挑取單菌落接種至5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃劇烈震搖過夜.2.2000g,4℃,離心5min,收集菌體.3.在每個離心管中加5ml預冷的STE,用移液器吹懸細菌沉淀.按步驟2離心收集細菌.4.將菌體重懸于200ul冰冷的堿性裂解液I中.將菌體轉(zhuǎn)移至預冷的微量離心管中,置于冰上.5.向管中加入400μl新鮮配置的堿性裂解液II.輕輕翻轉(zhuǎn)數(shù)次,將離心管置于冰上.6.向管中加入300μl冰冷的堿性裂解液III,輕輕翻轉(zhuǎn)數(shù)次.將離心管置于冰上5min.7.在微量離心機上以Zda速度4℃離心5min,除去細胞碎片沉淀.將上清移入一新的微量離心管中.室溫下加入900μl異丙醇,輕輕翻轉(zhuǎn)數(shù)次離心管,混勻.8.立即在微量離心機上室溫下Zda速離心5min,使核酸沉淀.棄去上清,用1ml70%乙醇小心漂洗.室溫下離心2min,吸去乙醇.室溫干燥沉淀5-10min后,將沉淀溶于50μlTE(pH8.0)中.[詳細]
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2018-11-16 10:02
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全血基因組DNA提取試劑盒說明書
- 全血基因組DNA提取試劑盒說明書貨號:D1800規(guī)格:50T/100T保存:室溫(15℃-25℃)干燥保存,復檢期12個月,2℃-8℃保存時間更長。試劑盒內(nèi)容:50T100TRNaseA1ml1ml×2蛋白酶K1ml1ml×2紅細胞裂解液120ml120ml×2溶液A15ml25ml溶液B15ml30ml漂洗液15ml30ml洗脫液10ml20ml吸附柱50個100個收集管50個100個說明書1份1份產(chǎn)品簡介:本試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統(tǒng),提取全血基因組DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料為本公司特有新型材料,能夠GX、專一吸附DNA,可Zda限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物。提取的基因組DNA片段大,純度高,質(zhì)量穩(wěn)定可靠。使用本試劑盒提取的基因組DNA可用于各種常規(guī)操作,包括酶切、PCR、文庫構(gòu)建、Southern雜交等實驗。操作步驟:使用前請先在漂洗液和溶液B中加入無水乙醇,加入休積請參照瓶體上的標簽。所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。1、樣品的處理(本產(chǎn)品適用于處理新鮮的或已經(jīng)添加抗凝劑的0.lml-1ml血液樣品):a、在血液樣品中加入2-3倍體積的紅細胞裂解液,充分顛倒混勻,12000rpm離心1min,小心吸去上清,沉淀應為白色或淡紅色,如果裂解不徹底,可重復以上述步驟一次。向沉淀中加200ul溶液A,振蕩至徹底混勻。b、如果處理的血樣為禽類、鳥類、兩棲類或更低級生物的血液,其紅細胞為有核細胞,因此處理量為5-20u1,不需要再用紅細胞裂解液處理,直接加200ul溶液A,振蕩至徹底混勻。2、向懸浮液中加入20ul(10mg/ml)的RNaseA,充分顛倒混勻,室溫放置10min。3、加入20ul(10mg/ml)的蛋白酶K,充分顛倒混勻,65℃水浴消化30-60min,消化期間可顛倒離心管混勻數(shù)次,直至樣品消化完全為止。4、加入2倍體積溶液B(使用前請先檢查是否己加入無水乙醇),充分顛倒混勻,此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀,不影響DNA的提取,可將溶液和絮狀沉淀都加入股附柱中,室溫放置2min,5、12000rpm離心2min,棄廢液,將吸附柱放入收集管中。6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12000rpm離心1min,棄廢液,將吸附柱放入收集管中。7、向吸附柱中加入500ul漂洗液,12000rpm離心1min,棄廢液,將吸附柱放入收集管中。8、12000rpm離心2min,將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘,目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR等。9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中,向吸附膜ZY懸空滴加50-200ul經(jīng)65℃水浴預熱的洗脫液,室溫放置5min,12000rpm離心1min。10、離心所得洗脫液再加入吸附柱中,12000rpm離心2min,即可得到高質(zhì)量的基因組DNA。注意事項:1、本試劑盒置于室溫(15-25℃)干燥條件下可保存12個月,更長時間的保存可置于2-8℃。2、常用的血液抗凝劑有EDTA、ACD和肝素等,需注意的是,如欲制各大分子量血液基因組DNA,可優(yōu)先考慮使用ACD抗凝。一般不使用肝素抗凝,因為用肝素抗凝的血液提取的基因組DNA進行PCR擴增時,有PCR擴增YZ現(xiàn)象。3、樣品應避免反復凍融,否則會導致提取的DNA片段較小且提取量也下降。4、如果試劑盒中的溶液出現(xiàn)沉淀,可在65℃水浴中重新溶解后再使用,不影響效果。5、絕大多數(shù)哺乳動物的全血如入全血中的紅細胞無核,故在提取基因組DNA時需去除不含DNA的無核紅細胞,以免影響紅細胞裂解和DNA釋放。如果處理的血樣為禽類、鳥類、兩棲類或更低級生物的血液,其紅細胞為有核細胞,因此處理量減少為5-20ul,不需要再用紅細胞裂解液來裂解紅細胞。6、洗脫緩沖液的體積**不少于50ul,體積過小會影響回收效率:洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響,若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍),pH值低于7.0會降低洗脫效率。相關(guān)產(chǎn)品:D1850全血基因組DNA提取試劑系統(tǒng)E1020EB染色液D10106×DNALoadingBufferT106050×TAE緩沖液T10505×TBE緩沖液M1060D2000DNALadderM14001kbDNALadderG8142GoldViewII型核酸染色劑(5000×)全血基因組DNA提取試劑盒說明書現(xiàn)貨促銷全血基因組DNA提取試劑盒說明書現(xiàn)貨促銷ShanghaisolarbioBioscience&TechnologyCo.,LTD上海索萊寶生物科技有限公司是一家集銷售生化試劑、實驗耗材、自產(chǎn)分子生物學產(chǎn)品為一體,并能提供技術(shù)支持的專業(yè)性生物科技公司。公司秉承“以客戶為ZX,以產(chǎn)品為保障、以誠信為基礎(chǔ)、以創(chuàng)新為宗旨”的發(fā)展理念,在依靠客戶的大力支持和員工的不懈努力下獲得了快速的成長。公司組織結(jié)構(gòu)清晰,內(nèi)部管理科學,擁有一支既分工細致又高度合作的年輕化隊伍,保持了各個部門之間的GX合作運轉(zhuǎn),充分保障了公司在充滿競爭的市場中處于領(lǐng)xian地位。公司注重與業(yè)界精英合作,目前公司已經(jīng)和Amersham、Amresco、Axygen、BD、Corning、Dragon、Eppendorf、Fluka、Hyclone、Merck、Millipore、Omega、Oxoid、Pall、Peprotech、Pharmacia、Pierce、Roche、Sigma、Serva、TBD、Whatman、GBD、ADL、R&D、RB等企業(yè)結(jié)成緊密的合作伙伴關(guān)系,代理其領(lǐng)xian世界的產(chǎn)品,并在全國各地設(shè)有分銷機構(gòu)。我們將以高度的責任感和出色的產(chǎn)品質(zhì)量為客戶提供高品質(zhì)的產(chǎn)品和實驗技術(shù)解決方案。豐富的經(jīng)驗、優(yōu)良的品質(zhì)、充足的庫存、準確的交貨時間、極具競爭力的價格,所有這些都保證了我們向您提供的是Z專業(yè)Zyou質(zhì)的服務!立足北京,上海,輻射全國,隨著產(chǎn)品營銷戰(zhàn)略的不斷延伸,我們將逐步發(fā)展成為yi流的專業(yè)性生物科技公司。我們希望能夠和尊敬的客戶一起,利用各自的資源優(yōu)勢和勇于進取的敬業(yè)精神,為ZG生命科學研究的發(fā)展作出更多的貢獻。為了更好、更全面的發(fā)展,現(xiàn)公司正在誠招各地dai理商和招聘若干銷售、研發(fā)人員,歡迎垂詢并期待您的加入!全血基因組DNA提取試劑盒說明書現(xiàn)貨促銷全血基因組DNA提取試劑盒說明書現(xiàn)貨促銷聯(lián)系方式上海索萊寶生物科技有限公司電話:021-6485566518018609966傳真:021-54261506郵編:200233地址:上海市欽江路15號14層郵箱:solarbio@126.com網(wǎng)址:www.shsolarbio.com全血基因組DNA提取試劑盒說明書現(xiàn)貨促銷上海索萊寶021-54100800[詳細]
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2018-09-02 10:00
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