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純化線粒體膜通道孔(MPTP)熒光檢測(cè)試劑盒

本文由 上海語(yǔ)燕生物技術(shù)有限公司 整理匯編

2018-11-19 10:00 701閱讀次數(shù)

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主要用途純化線粒體膜通道孔(MPTP)熒光檢測(cè)試劑是一種旨在通過鈣黃綠素載入后離心處理或鈷淬滅技術(shù),選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色,而存在于或由線粒體釋放到線粒體外的熒光染料,即刻發(fā)生熒光去除或淬滅,來分析和觀察線粒體膜通道孔活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種純化線粒體膜通道孔活性(瞬時(shí)或長(zhǎng)期開放狀態(tài))的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,活體檢測(cè),分辨率高,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定。技術(shù)背景線粒體膜通道孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore;MPTP)是由線粒體內(nèi)外膜成分構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時(shí),線粒體內(nèi)容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。膜通道孔的開放,顯著改變線粒體的通透性。鈣離子過度進(jìn)入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開放,而造成細(xì)胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失。鈣黃綠素-AM,又稱雙甲亞胺二乙酸鈉熒光素-乙酰氧基甲基酯【bis(bis-carboxymethylaminomethylfluorescein)-acetoxymethylester】,作為熒光探針:**,適宜的分子量622kd,小于1.5kd;第二,幾乎不具有膜結(jié)合性;第三,不是線粒體酶的底物;第四,容易進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體。鈣黃綠素-AM進(jìn)入線粒體后,被內(nèi)酯酶切離,產(chǎn)生具有極性的熒光性強(qiáng)的鈣黃綠素,被線粒體俘獲。同時(shí)線粒體外的鈣黃綠素通過離心去除或受到其淬滅劑鈷離子的淬滅。一旦線粒體膜通道孔瞬時(shí)開放,鈣黃綠素釋放出線粒體外,由于離心處理或被鈷離子淬滅。線粒體內(nèi)鈣黃綠素?zé)晒獾淖兓砻髂ねǖ揽椎拈_放狀態(tài)。產(chǎn)品內(nèi)容染色液(ReagentA)微升中和液(ReagentB)毫升保存液(ReagentC)毫升產(chǎn)品說明書1份保存方式保存染色液(ReagentA)在-20℃冰箱里,避免光照;其余的保存在4℃冰箱里;有效保證6月用戶自備黑色96孔板:用于線粒體熒光分析的容器1.5毫升離心管:用于線粒體染色的容器載波片/蓋玻片:用于線粒體樣品存放后熒光分析微型臺(tái)式離心機(jī):用于沉淀線粒體培養(yǎng)箱:用于染色孵育(共聚焦)熒光顯微鏡:用于線粒體熒光分析熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀:用于線粒體熒光定量分析實(shí)驗(yàn)步驟直接法準(zhǔn)備好待測(cè)的純化線粒體樣品移取100微升線粒體樣品(總量為0.2毫克)到1.5毫升離心管加入xx微升染色液(ReagentA),混勻放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘,避免光照放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf5415)小心抽去上清液加入xx微升37℃預(yù)熱的保存液(ReagentC),混勻顆粒群放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf5415)小心抽去保存液(ReagentC)小心加入xx微升37℃預(yù)熱的保存液(ReagentC),混勻顆粒群選擇下列方式之一進(jìn)行操作:(A)使用(共聚焦)熒光顯微鏡觀察(定性檢測(cè)):1)移取10微升上述懸液到載波片上,蓋上蓋玻片2)激發(fā)波長(zhǎng)488nm,散發(fā)波長(zhǎng)505nm――綠色熒光減弱,表明膜通道孔活性(MPTP)增強(qiáng)或使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)(定量檢測(cè)):1)移取100微升上述懸液到100微升比色杯或黑色96孔板2)即刻放進(jìn)熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀:激發(fā)波長(zhǎng)488nm,散發(fā)波長(zhǎng)505nm――RFU降低,表明膜通道孔活性(MPTP)增強(qiáng)間接法實(shí)驗(yàn)開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的染色液(ReagentA)置入冰槽里融化,中和液(ReagentB)放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升染色液(ReagentA)到新的1.5毫升離心管,加入xx微升中和液(ReagentB),混勻后,標(biāo)記為染色工作液,置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。準(zhǔn)備好待測(cè)的純化線粒體樣品移取100微升線粒體樣品(總量為0.2毫克)到1.5毫升離心管放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf5415)小心抽去上清液加入xx微升含有染色液(ReagentA)和中和液(ReagentB)的染色工作液,充分混勻放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘,避免光照選擇下列方式之一進(jìn)行操作:使用(共聚焦)熒光顯微鏡觀察(定性檢測(cè)):1)移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上,蓋上蓋玻片(每隔5分鐘檢測(cè)一次,持續(xù)30分鐘)2)激發(fā)波長(zhǎng)488nm,散發(fā)波長(zhǎng)505nm――綠色熒光減弱,表明膜通道孔活性(MPTP)增強(qiáng)或使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)(定量檢測(cè)):1)移取100微升上述懸液到100微升比色杯或黑色96孔板2)即刻放進(jìn)熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀(每隔5分鐘檢測(cè)一次,持續(xù)30分鐘):激發(fā)波長(zhǎng)488nm,散發(fā)波長(zhǎng)505nm――RFU降低,表明膜通道孔活性(MPTP)增強(qiáng)

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