簡介
隨著高度復(fù)雜的基于細胞的二維和三維分析技術(shù)在生物研究中的應(yīng)用日益廣泛，人們迫切需要提高自動化高內(nèi)涵成像能力。在此，我們展示了使 用 ImageXpress Confocal HT.ai 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)在檢測靈敏度、分析質(zhì)量和采集速度方面的提升。使用高功率激光光源，該系統(tǒng)可顯著增加樣品的光通量，從而產(chǎn)生更明亮的圖像、更高的靈敏度和更高的檢測通量。這種影響對于靈敏度和成像時間是限制因素的檢測尤其重要。為了證明激光光源的實際影響，我們展示了幾個復(fù)雜生物學的檢測系統(tǒng)結(jié)果：GPCR 活化檢測、腫瘤細胞球和肺類器官。

方法
儀器
ImageXpress Confocal HT.ai 系統(tǒng)配備了多線激光光源與相匹配的濾片，跨越 405nm 到 730nm 激發(fā)。與上一代 LED 光源相比，該光源為樣品提供了顯著增強的照明功率。

優(yōu)勢
? 使用激光光源提高圖像強度和檢測靈敏度
? 曝光時間減少 3-4 倍，相應(yīng)的成像時間減少 1.5-3倍
? 保證您的檢測獲得高質(zhì)量圖像

在下面的示例中，比較了 ImageXpress Confocal HT.ai系統(tǒng)和上一代 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)。
細胞檢測
如前所述，使用表達 GFP 標記的 beta- arrestin 的細胞系進行 Transfluor 檢測，該細胞系在激活時與感興趣的受體相關(guān) 1。用異丙腎上腺素刺激細胞，引起聚集的內(nèi)化受體 (pits) 的劑量依賴性表現(xiàn)，這些受體在 FITC 通道中用 20X Plan Apo 物鏡 (60′ 轉(zhuǎn)盤 ) 呈現(xiàn)出來。如前所述，使用 U 型底低附著 (Corning) 微孔板從 HTC116 結(jié)腸癌細胞 系 (ATCC) 形 成 3D 細 胞 球 2(Sirenko, 2015)。細胞球用anticancer藥物處理 48 小時，用DRAQ5、HCS CellMask Orange 或 AF555 Phalloidin 和Whole Cell Green 或 AF488 Phalloidin (Thermo FisherScientific) 固定和染色。細胞球用 20X Plan Apo 物鏡進行 3D ( 5 μm 步進 Z 軸系列 ) 成像。在 MetaXpress 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件中對Z大投影圖像進行細胞分析。

3D 類器官是由原代人肺上皮細胞 (ScienCells) 在Matrigel (Corning) 圓頂中形成的，使用 Stem CellTechnologies 試 劑盒和方案制備 3。成熟的肺類器官 ( 發(fā)育 6 周后 ) 被固定并用 Hoechst、MitoTrackerOrange 和 AF488 Phalloidin 染色。10X 放大倍率以 3D(Z-stack 范 圍 150-250 μm) 方式對類器官成像并使用MetaXpress 3D 圖像分析工具分析圖像。

結(jié)果
GPCR 活化檢測 , Transfluor
G 蛋白偶聯(lián)受體是Z大的一類藥物靶點，在生物篩選分析中起著重要作用。Transfluor 檢測定量 GFP 標記的beta-arrestin 蛋白的內(nèi)化，beta-arrestin 蛋白與感性趣的激活的受體有關(guān)。這種內(nèi)化導(dǎo)致出現(xiàn)小的熒光斑點，這些熒光斑點通過高內(nèi)涵成像進行計數(shù)和特征描述。

這些斑點相對較暗，用 LED 光源需要 1 秒左右的曝光。ImageXpress Confocal HT.ai 系統(tǒng)的激光光源可將曝光時間減少 3-4 倍，與此同時成像時間可減少 33%% ( 獲得1.5 倍 檢測速度 )。另外，檢測 Z′ 值也提高了約 20%。

圖 1 A. 用異丙腎上腺素激活受體后形成的綠色小點。Hoechst ( 藍色 ) 染細胞核。對 LED 和激光光源 ( 針對激光進行了優(yōu)化 ) 使用相同的曝光時間獲取圖像。 B. 使用激光光源使優(yōu)化的曝光時間和成像時間大大減少了。 C. 比較激光和 LED 系統(tǒng)拍攝的圖像的檢測質(zhì)量 (Z' 值 )。
3D 癌細胞球
在第二個實驗中，我們比較了 LED 激發(fā)與激光激發(fā)的標準成像系統(tǒng) ImageXpress Confocal。HCT-116 細胞球在圓形底孔板中生長 4 天，一些孔在Z后兩天接受 5μM細胞松弛素 D 或諾科達唑的anticancer化合物處理。固定細胞球并用DRAQ5 ( 核 )、Whole Cell Green 和 Alexa Fluor555 Phalloidin ( 肌動蛋白 ); 或 DRAQ5、HCS CellMaskOrange ( 全細胞 ) 和 Alexa Fluor 488 Phalloidin ( 肌動蛋白 ) 染色。用 20X Plan Apo 物鏡采集 Z 軸系列圖像，采集的球體深度為 150 μm (31 層，5 μm 步進 )。對Z大投影圖像進行圖像分析，計算細胞核數(shù)，確定球體面積。這些圖像不管使用 LED 還是激光激發(fā)采集，都是以產(chǎn)生 14 位圖像的曝光獲取的。通過獨立優(yōu)化每個光源的曝光時間，根據(jù)收集的通道和使用的熒光團數(shù)量，使用激光采集 3D 細胞球的時間大約是 LED 采集時間的一半。

圖 2 A. 未處理細胞球 ( 右半邊 ) 經(jīng) DRAQ5 和 Phalloidin-AF488 染色疊加的 2D 投影圖像和核分割掩模 ( 左半邊 )。B. 曝光時間優(yōu)化以獲得同等像素強度的圖像。針對不同的染色方法需要不同的曝光。C. 在 ImageXpress Confocal HT.ai 系統(tǒng)中用 20X，對比 LED 和激光光源采集 96 孔細胞球孔板的速度。

圖 3 A. Matrigel 中類器官培養(yǎng)的共焦圖像 ( Z大投影 )，10X。B. 使用相同的 LED 和激光光源曝光時間拍攝圖像。 代表性圖像顯示的物體 ( 線粒體完整的細胞 ) 的細胞計數(shù)和平均強度。 C. 曝光時間匹配 (14 位強度范圍 ) 的激光和 LED。通過使用激光，優(yōu)化的曝光時間和成像時間大大縮短。
3D 肺類器官
肺類器官培養(yǎng)從原代肺上皮細胞開始，然后使用 StemCell Technologies 的試劑和方案在基質(zhì)凝 膠圓頂中生長。簡單地說，細胞首先在 2D 中擴增，然后與生長因子還原的 Matrigel 混合，并以 24 孔板或其他孔板形式接種到 Matrigel 圓頂中。類器官對于疾病建模和評估化合物作用是非常有用的工具。類器官的自動成像和分析是定量評估類器官表型變化和提高類器官實驗通量的重要方法。共聚焦成像和 3D 圖像分析對于捕捉 3D 生物系統(tǒng)的復(fù)雜性特別有用。

我們已經(jīng)評估了激光對 3D 類器官樣品成像的影響。類器官包括具有復(fù)雜空腔和囊泡結(jié)構(gòu)的球形物體，這些物體通過 Matrigel 用 20-30 層 Z 軸平面以 10X-40X 放大倍率成像。用已知會損傷肺組織的化合物處理類器官，并用可見的線粒體、細胞骨架和細胞連接的標記物染色。進行 3D 體積分析以計數(shù)和表征類器官和類器官內(nèi)的細胞。我們能觀察到像素強度、分辨率和物體銳利度的提高，從而得到更高質(zhì)量的分析。重要的是，由于總曝光時間減少了 8 倍，成像速度提高了 2.3 倍 ( 時間縮短了 51-57% )。
激光光源對檢測速度和通量的影響
為了測試激光對高內(nèi)涵篩選分析的檢測速度和通量的影響，我們比較了 5 位科學家進行的 10 次獨立檢測的曝光時間和
采集速度。下面的數(shù)據(jù)說明了觀察到的這 10 次檢測的曝光時間減少和速度增加 ( 時間縮短 )。

總結(jié)
激光光源的照明功率顯著提高了圖像強度和檢測靈敏度，這對于較暗的樣品尤為重要。激光成像系統(tǒng)大大減少了曝光時
間，從而提高了成像速度和檢測通量。3D 成像尤其得益于激光光源。我們描述了幾種生物學檢測，并證明了更高的圖
像強度和改善的圖像質(zhì)量，從而提高了檢測靈敏度和成像速度。