摘要
細(xì)胞遷移，即細(xì)胞的重新定位，與傷口愈合、免疫學(xué)、胚胎發(fā)育和不規(guī)則細(xì)胞事件( 如癌癥轉(zhuǎn)移 ) 有關(guān)。細(xì)胞遷移測定法用于測量細(xì)胞在受控環(huán)境中的運(yùn)動(dòng)，經(jīng)常手工制備和分析。在這個(gè)項(xiàng)目中，我們利用了一種適應(yīng)性細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，在微孔板的每孔中加入了一種圓形的、可溶解的生物相容性凝膠，以確定 Pico 個(gè)人型高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)是否能夠有效地成像和分析細(xì)胞遷移。我們研究了兩種不同的癌細(xì)胞系的遷移：HT1080 ( 來自人類纖維肉瘤細(xì)胞 )和 U2 OS ( 來自人類骨肉瘤細(xì)胞 )，這兩種癌細(xì)胞系被以優(yōu)化的密度在包含圓形生物相容凝膠的 384 孔板中沉積，生成融合單層。在不同濃度下評(píng)價(jià)了 5 種抑制細(xì)胞遷移的化療藥物，并測量了 45 小時(shí)以上對(duì)細(xì)胞活力的影響。我們收集了一系列的延時(shí)圖像，以便隨著時(shí)間的推移可以測量無細(xì)胞區(qū)域的閉合情況。利用圖像分析軟件對(duì)細(xì)胞所覆蓋的井面積進(jìn)行量化。比較了透射光圖像和熒光圖像的分析結(jié)果。結(jié)果表明秋水仙堿、松胞菌素 D 和諾科達(dá)唑在一定濃度下抑制細(xì)胞遷移。Z后，這些實(shí)驗(yàn)
表明，IamgeXpressPico 個(gè)人型高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)可以有效地成像和分析細(xì)胞遷移分析在透射光和熒光。
介紹
細(xì)胞遷移在胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、傷口愈合和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等許多生物學(xué)過程中是必不可少的。在先天免疫系統(tǒng)的激活過程中，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞通過對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)和趨化因子梯度的響應(yīng)遷移到炎癥部位。在大多數(shù)情況下，這是有益的，因?yàn)榍宄軗p組織是非常重要的，組織的再生也是非常重要的，這是由 M2 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌所促進(jìn)的 (Shiraishi et al., 2016; Julier etal., 2017)。然而，在包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的許多自身免疫性疾病中，免疫細(xì)胞的遷移和積累會(huì)產(chǎn)生災(zāi)難性的影響 (Neviuset al., 2016)。此外，在受癌癥影響的個(gè)體的腫瘤微環(huán)境中，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)被上調(diào)，從而加劇了癌癥的進(jìn)展 (Barret et al., 2017)。因此，在研究疾病的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)潛在的治療方法和候選藥物時(shí)，細(xì)胞遷移和這種運(yùn)動(dòng)的測量是一個(gè)有趣的領(lǐng)域。細(xì)胞遷移試驗(yàn)用于測量細(xì)胞在受控環(huán)境下的運(yùn)動(dòng)能力。通常，“劃痕”分析用于此目的。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞在微孔板中聚合后，通常用吸管尖在每孔中制造一道薄薄的劃痕或傷口。隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞會(huì)遷移到受傷區(qū)域。雖然這種方法是可以承受的，但是在孔中，傷口的大小和位置往往不相同，手工制備劃痕既費(fèi)力又費(fèi)時(shí)，而且不能采用 384 孔板模式進(jìn)行篩選。為了提高通量和可重復(fù)性。Platypus 技術(shù)將這種檢測方法應(yīng)用于包含圓形可溶解生物相容凝膠 ( 384 well Oris Pro 板 ) 的微孔板。圓形凝膠在每個(gè)孔中間形成均勻的無細(xì)胞區(qū)，并在細(xì)胞鋪板一小時(shí)后自行溶解。該方法具有細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和高通量，與高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)兼容。
在本次研究中，細(xì)胞遷移的纖維肉瘤和骨肉瘤細(xì)胞株被鋪在 384 孔板中，成像和分析使用 ImageXpress Pico 個(gè)人型高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)和 CellReporterXpress? 自動(dòng)成像和分析軟件。本研究的目的是證明可重復(fù)性的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)可以用通過個(gè)人型高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)來完成。此外，采用松胞菌素 D、秋水仙堿、諾科達(dá)唑等化療化合物，以合適的濃度處理細(xì)胞遷移孔。

我們假設(shè)化療藥物會(huì)抑制細(xì)胞遷移，而高內(nèi)涵系統(tǒng)可以成功地成像和分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。在這里，我們展示了松胞菌素 D、秋水仙堿和諾科達(dá)唑在檢測濃度下顯著抑制細(xì)胞遷移，并且可以使用高內(nèi)涵系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞遷移成像和分析。
材料
? 檢測試劑盒細(xì)胞

HT1080 纖維肉瘤細(xì)胞株(ATCC P/N CCL-121)U2 OS

骨瘤細(xì)胞系(Millipore Sigma P/N CLL1037)
SiR - Actin試劑盒(Cytoskeleton Inc. P/N CY-SC001)

胞嘧啶 β-D- 阿拉伯糖苷鹽酸鹽 (Ara C)(Sigma Aldrich P/N C1768)
Oris? Pro 細(xì)胞.遷移 (PlatypusTechnologies P/N PRO384CMA1)
生物相容凝膠 ( 384 well Oris Pro 板 ) 的微孔板。圓形凝膠在每個(gè)孔
? 全自動(dòng)成像分析
ImageXpress Pico 個(gè)人型高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)，配有 CellReporterXpress 軟件(Molecular Devices, LLC)。
方法
在孔板中鋪種上用熒光染料和細(xì)胞抑制劑處理過的細(xì)胞
當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)基中被稀釋至各自的工作濃度后，胞嘧啶 β-D- 阿拉伯糖苷鹽酸鹽 (AraC)，一個(gè)已知的細(xì)胞分裂抑制劑，以及SiR-Actin， 一個(gè)已知的對(duì)活細(xì)胞骨架蛋白無害的熒光染料，分別按照 20 μM 和 0.1 μM 的終濃度被添加到孔板體系中。使用細(xì)胞抑制劑的目的是為了確保只檢測到細(xì)胞遷移，而不是細(xì)胞增殖。細(xì)胞在經(jīng)過細(xì)胞抑制劑和骨架蛋白染料處理之后，被鋪種到 384 孔的 Oris Pro 細(xì)胞遷移板中，每孔10,000 個(gè)細(xì)胞，Z終體系為 30 μl。

結(jié)論：
? 在給定藥物濃度下，秋水仙堿、松胞菌素 D 和諾科達(dá)唑顯著降低細(xì)胞遷移
? 透射光和熒光分析之間的一致性表明細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)可以在無標(biāo)記的細(xì)胞系中進(jìn)行，也可以 SiR -Actin 熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞中進(jìn)行

? 使用 OrisPro 384 孔遷移試驗(yàn)，可以進(jìn)行細(xì)胞遷移抑制劑的中等通量篩選
? 使用 ImageXpress Pico 個(gè)人型高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)和 CellReporterXpress 軟件，可以方便地對(duì)時(shí)間推移分析進(jìn)行成
像和分析