摘要
類器官模型因其能夠再現(xiàn)真實組織的復(fù)雜性而在生物研究和篩選中越來越受歡迎。為了模擬體內(nèi)的人體肺器官，我們在有助于 3D 結(jié)構(gòu)形成的條件下培養(yǎng)了原代人肺上皮細(xì)胞，重現(xiàn)了肺氣道形態(tài)和功能上的特征。在肺類器官培養(yǎng)中，上皮干細(xì)胞和祖細(xì)胞在添加了一系列生長因子的 ECM 中培養(yǎng)。類器官隨后生長成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，保留了多系上皮細(xì)胞簇。這些特性使類器官培養(yǎng)成為一種富有前景的手段，可以廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化方法，如藥物篩選和疾病建模。
這里我們闡述了一種高內(nèi)涵成像方法，可以監(jiān)測和可視化肺類器官的生長和分化，3D 結(jié)構(gòu)的重建，類器官結(jié)構(gòu)的復(fù)雜分析，細(xì)胞形態(tài)和活力，以及不同細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。3D 肺類器官植入在 Matrigel domes。發(fā)育中的類器官包括具有復(fù)雜形態(tài)的球形物體，包括腔和膀胱結(jié)構(gòu)。在 8 周的生長過程中，我們監(jiān)測到了大小和復(fù)雜性的增加。用透射光監(jiān)測類器官，然后用 20-30 層 Z 軸掃描透過基質(zhì)凝膠對染色的類器官成像，物鏡倍數(shù)為 10 – 40x。使用 ImageXpressConfocal HT.ai 智能化共聚焦高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)新配置的激光光源顯著的提高照明強(qiáng)度，從而顯著提高了亮度、檢測靈敏度和成像速度。
方法
細(xì)胞：3D 肺類器官
3D 肺類器官是由人體原代肺上皮細(xì)胞 (ScienCells, Co.)分離而來。按照 ScienCells 的方法，細(xì)胞在 2D 范圍內(nèi)增殖兩 周。然后，根據(jù) Stem Cell Technologies 公司生產(chǎn)的 PneumaCult ? Airway Organoid Kit 的方案，用試劑將細(xì)胞在 90% 的 Matrigel (Corning) 中接種到Matrigel domes。細(xì)胞形成 3D 類器官，在培養(yǎng)的 2 周內(nèi)每隔 2 天更換一次 PneumaCult Airway Organoid 培養(yǎng)基，然后再使用 PneumaCult Airway Organoid 分化培養(yǎng)基培養(yǎng) 6 周。使用不同的孔板類型培養(yǎng)類器官 ( 見結(jié)果部分 )，然后用化合物處理或各種標(biāo)記物標(biāo)記以評價形態(tài)學(xué)和活性。每周用 4 倍或 10 倍物鏡在透射光下監(jiān)測類器官的生長和發(fā)育。工作流程的示意圖如下所示。

類器官成像和 3D 分析
在染色緩沖液中加入染色試劑，并將其加入到一半的培養(yǎng)基中，通常對 3D 肺類器官染色 2 小時。移除染色試劑，用 PBS 沖洗 30 分鐘，加入新鮮培養(yǎng)基。類器官樣本可以進(jìn)行活細(xì)胞成像，或用 4% 甲醛固定，保存在室溫下用于以后成像。使用帶有水鏡的 ImageXpress Confocal HT.ai 系統(tǒng)對類器官樣本成像。使用 4x 和 10x物鏡下做共聚焦拍攝，20x 或 40x 圖像用水鏡和共聚焦拍攝，根據(jù)物鏡覆蓋范圍 150-250 μm，每隔 3-10 μm 拍攝 Z-stack 圖像。3D 圖像分析在 MetaXpress 高內(nèi)涵成像獲取和分析軟件中完成。
儀器

圖 1 用共聚焦拍攝監(jiān)測類器官結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性?；畹念惼鞴俦?Hoechst，MitoTracker 和 Calcein AM 染色。10x 或 20x，每隔 5-10 μm 做共聚焦成像。A. Z大的投影圖片。B. 單個 Z 平面的共聚焦圖像顯示，可以觀察和測量管腔、空腔和突起，與更成熟表型的外觀一致。
結(jié)果
3D 肺類器官的培養(yǎng)與成像
從原代肺上皮細(xì)胞開始培養(yǎng)，然后使用 Stem CellTechnologies 公司 ( 見方法 ) 提供的試劑和方案在Matrigel domes 培養(yǎng)類器官。簡單的說，細(xì)胞在 2D 中擴(kuò)增，然后與添加生長因子基質(zhì)膠 (Matrigel) 混勻并接種到 24 孔或其他類型孔板內(nèi)的 Matrigel domes 中。
2D 擴(kuò)增 → Matrigel dome 3D → 分化 → 實驗
類器官的生長監(jiān)測和 3D 圖像分析
通過透射光成像或者 Hoechst 染色監(jiān)測類器官的生長和發(fā)育。用共聚焦對 Matrigel 中的類器官做自動的活細(xì)胞成像，4x 或 10x 物鏡。通過對單個 Z 平面或 3D 投影的圖片分析可以確定類器官的大小和數(shù)量。在 6-8 周的培養(yǎng)中可以觀察到大小隨時間的變化。

圖 2 A. 在 Matrigel dome 中培養(yǎng)了 4 個星期的類器官，透射光圖像 (4x) 或 Hoechst 染色圖像 (10x)。類器官的平均直徑隨著時間增長。B. 類器官大小的對比， Hoechst 染色兩星期 ( 藍(lán)色 )，Hoechst and MitoTracker Orange ( 紅色 ) 染色的 6 星期樣本。用共聚焦拍攝類器官，10 μm 間隔在 Z 軸方向拍攝 23 張圖片。Z大的投影圖片如上圖顯示。

圖 3 利用 3D 分析模塊做圖像分析，重新定義類器官結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。類器官 (A)，使用 CME 模塊 (Custom Module Editor) 可以識別，計數(shù)，定義細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu) (B)。分析會應(yīng)用在每個 Z 平面，然后軟件會結(jié)合這些信息做出 3D 空間上的檢測結(jié)果。
結(jié)果
表型變化及化合物作用的檢測
類器官為疾病模型和化合物藥效評價提供了一個非常有效的工具。對類器官自動化的成像和分析對于定量評價類器官的表型變化以及提高實驗和檢測通量是非常重要的。
2D 投影圖片的分析可以用于高通量實驗中。例如下面的圖片顯示了對照組類器官與炎癥細(xì)胞因子和毒性試劑處理的類器官做活－死細(xì)胞分析。

圖 4 用 5 nM TNFα 處理類器官 3 天。用 Hoechst ( 藍(lán)色，核染料 ) 和 EtHD ( 紅色，死細(xì)胞染料 ) 染色類器官，10x 物鏡成像，Z大的投影面。圖像在 2D 水平下分析活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)量。
共聚焦成像和 3D 圖像分析對于獲取 3D 生物學(xué)實驗的復(fù)雜性非常有效。3D 類器官有中空表型，在內(nèi)里有腔，更容易被光穿透，能夠?qū)η度牖|(zhì)中的多個顯微組織成像。
一些抗腫瘤藥物，如 ibrutinib，被用于治療白血病，已被證明會引起肺毒性。我們用 3D 肺類器官測試了抗腫瘤藥物 ibrutinib 的毒性。

圖 5 類器官在經(jīng)過 6 個星期的發(fā)育后，被不同濃度的 ibrutinib 處理 72 h。然后用 EtHD-1 染色類器官用來檢測死細(xì) 胞，使用 ImageXpress Confocal HT.ai system 拍攝。EtHD-1 陽性 ( 死細(xì)胞 ) 和陰性 ( 活細(xì)胞 ) 的數(shù)量通過 3D 分析計數(shù)并計算 EC50。
有趣的是，Ibrutinib 在 EC50 ~3 μM 時觀察到顯著的細(xì)胞毒性，而同樣的細(xì)胞在 2D 培養(yǎng)條件下只有在 100 μM 濃度下才能觀察到毒性作用。這一結(jié)果可能表明 3D 模型對選定藥物的細(xì)胞毒性作用具有更高的敏感性，這就強(qiáng)調(diào)了使用更復(fù)雜的模型來評價化合物效應(yīng)的重要性。
總結(jié)
使用 Stem Cell Technology 公司的方案可以成功的形成 和發(fā)育 3D 肺類器官。類器官在基質(zhì)膠中的生長和發(fā)育可以通過自動成像獲取，并用于評價類器官的大小，體積和復(fù)雜性。
共聚焦成像結(jié)合 3D 分析可以定量細(xì)胞特征，數(shù)量以及在類器官內(nèi)不同表型的細(xì)胞 ( 細(xì)胞個數(shù)，活 - 死細(xì)胞評價，特殊標(biāo)記物的細(xì)胞分類等等 )。該模型可以用于藥品和其他化合物的毒性評價。