擴(kuò)大針對(duì)腫瘤血管生成的自動(dòng)成管分析
血管生成是指從現(xiàn)有血管生成新的血管，是內(nèi)皮細(xì)胞萌發(fā)、增殖、遷移、侵襲和分化等多種生物學(xué)過(guò)程中的關(guān)鍵步驟1、2。血管生成失調(diào)是疾病狀態(tài)的標(biāo)志，并具有廣泛的臨床意義3-5。其中靶向腫瘤血管生成的療法已成為抑制腫瘤生長(zhǎng)的一種有前途的替代方法。為了開(kāi)發(fā)針對(duì)腫瘤的治療劑，必須建立一個(gè)能重現(xiàn)生理病理環(huán)境的強(qiáng)大體外血管生成模型，以評(píng)估內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)抑制性或刺激性化合物的反應(yīng)2。管形成分析是代表體內(nèi)微環(huán)境的模型之一1、6、7，它使研究人員能夠通過(guò)量化源自細(xì)胞外基質(zhì)中生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)管狀管狀結(jié)構(gòu)來(lái)快速評(píng)估抗血管生成作用 ( 圖 1 )。
本應(yīng)用說(shuō)明描述了我們開(kāi)發(fā)的一種自動(dòng)成管分析方法，它簡(jiǎn)化了圖像采集和分析，這是擴(kuò)大類似分析的主要瓶頸。通過(guò)結(jié)合熒光染色和高內(nèi)涵成像系統(tǒng)，可以更好地顯示完整的三維小管結(jié)構(gòu)，并可以產(chǎn)生多種表型測(cè)量來(lái)表征抗血管生成的作用。anticancer藥物蘇拉明 (Suramin) 用于證明我們方法的穩(wěn)健性，以確保分析通量，靈敏度和一致性。
材料
? Human umbilical vein endothelialcells (HUVEC) (ATCC, Cat #CRL-1730)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞
? 96-well cell culture plate 96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板
? Matrigel (Corning)
? Crystal Violet (MilliporeSigma)
? Calcein AM (Thermo Fisher Scientific)
? Suramin (MilliporeSigma)
? ImageXpress Micro Confocal 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)和 MetaXpress 高內(nèi)涵圖像獲取及分析軟件 (Molecular Devices)

優(yōu)勢(shì)
? 自動(dòng)化 3D 血管生成分析
? Z大限度減少量化管形成的勞動(dòng)量和時(shí)間
? 生成多種表型測(cè)量
? 高密度篩選抗血管生成物質(zhì)

圖 1 血管形成模型原理。 將 HUVEC 與基底基質(zhì)混合，然后接種到 96 孔微孔板中。 在對(duì)照組的培養(yǎng)條件下，毛細(xì)管狀的管狀結(jié)構(gòu)將自發(fā)形成，而在血管形成抑制劑存在的條件下，管狀結(jié)構(gòu)無(wú)法形成，而是積聚成團(tuán)。
方法
將 HUVEC 以每孔 15,000 個(gè)細(xì)胞鋪在 96孔微孔板中的預(yù)固化基質(zhì)膠上。 種上后立即用 0.4％ 對(duì)照或一系列蘇拉明稀釋液處理 HUVEC，稀釋液的濃度范圍為 1.25 μM至 80 μM。 在 37°C，5％ CO2 下孵育 18小時(shí)后，將細(xì)胞用 Calcein AM 或 CrystalViolet 染色。在 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)上，聯(lián)合使用 2X Plan Apo物鏡和用于 Calcein AM 和 Crystal Violet的FITC 和 Cy5 濾光片對(duì)板進(jìn)行成像。由于血管在 Matrigel 中形成了三維網(wǎng)絡(luò)，因此獲得了一系列沿 z 軸的 1.3 mm 范圍的圖像。Best-Focus 算法將每個(gè) z 層中的血管結(jié)構(gòu)時(shí)投影到二維圖像中，并通過(guò)MetaXpress 軟件中的自定義模塊分析所得圖像。自定義模塊提取并識(shí)別單個(gè)管狀或結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)，然后輸出總管長(zhǎng)度、總管面積、管號(hào)和節(jié)點(diǎn)號(hào)作為讀數(shù) ( 圖 2 )。為了確定蘇拉明的抗血管生成能力，我們將蘇拉明處理孔的結(jié)果與對(duì)照處理孔和無(wú)細(xì)胞處理孔進(jìn)行了比較。蘇拉明干預(yù)血管生成的有效性是通過(guò)將總管長(zhǎng)與對(duì)照管長(zhǎng)歸一化來(lái)確定的，并采用 4 參數(shù)非線性回歸擬合劑量序列。將Z小抑菌濃度 (MIC ≥30％) 評(píng)分為顯著響應(yīng)，并據(jù)此計(jì)算半效Z大抑菌濃度 (IC50)。

使用熒光染色劑改善管狀的可視化和定量
用結(jié)晶紫染色細(xì)胞并在光學(xué)顯微鏡下目視檢查是測(cè)量血管形成的Z典型方法。 由于內(nèi)皮細(xì)胞具有在基底膜樣基質(zhì)中生長(zhǎng)為三維網(wǎng)絡(luò)的特性，并且由于明場(chǎng)顯微鏡的固有局限性，因此在不均勻光照下準(zhǔn)確捕獲所有管狀結(jié)構(gòu)具有一定難度 ( 圖 3 A )。此外人工測(cè)量血管的形成是非常費(fèi)力的，以及受到主觀偏見(jiàn)的影響。這些缺陷損害了分析性能，限制了擴(kuò)大類似分析的可能性。

圖 2 管狀網(wǎng)絡(luò)的自動(dòng)定量。(A) 熒光染色顯示的管狀網(wǎng)絡(luò)的代表性圖像，及圖像分析步驟的示例。 (B) 通過(guò) MetaXpress 軟件識(shí)別的單個(gè)小管 ( 黃色 ) 和結(jié)節(jié) ( 藍(lán)色 ) 的相應(yīng)分割

圖 3 使用 2x PA 物鏡的管狀網(wǎng)絡(luò)的明場(chǎng)與熒光全孔圖像。 3D 堆疊后的熒光圖像質(zhì)量在視場(chǎng)和照明均勻性方面優(yōu)于明場(chǎng)

圖 4 蘇拉明的劑量依賴性抗血管生成作用。 HUVEC 在對(duì)照處理的孔中長(zhǎng)成管狀網(wǎng)絡(luò)，而蘇拉明處理的孔則顯示出劑依賴性的血管形成減少。注意，雖然 Crystal Violet ( 下部 ) 適用于明場(chǎng)和自發(fā)熒光成像，但 Calcein AM 染色劑 ( 上部 ) 顯示出更好的圖像對(duì)比度，并且孔邊緣附近的偽影更少
我們通過(guò)采用熒光染料和低倍物鏡來(lái)獲得管狀物的全孔圖像，克服了這些限制。與Crystal Violet 染色的明場(chǎng)圖像相比，Calcein AM 的熒光或 Crystal Violet 的自發(fā)熒光可提高圖像對(duì)比度，并且所得圖像幾乎沒(méi)有暈影 ( 圖 3B )。低倍物鏡的較長(zhǎng)景深和z軸自動(dòng)堆疊功能還有助于捕獲更多三維生長(zhǎng)的微管。 此外 Calcein AM 染色消除了對(duì)樣品固定的需要，并減少了清洗步驟，這是造成血管破裂或其他偽影的潛在原因。

為了展示此改良方案的性能，將蘇拉明 ( 一種已知可通過(guò)靶向成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 ( VEGF ) 受體信號(hào)傳導(dǎo)抑制血管生成的化合物 ) 用作陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)自動(dòng)分割從 3D 堆疊投影的熒光圖像，可以顯示和量化管狀和節(jié)狀結(jié)構(gòu) ( 圖 4 )。統(tǒng)計(jì)分析表明，如總管長(zhǎng)所示，蘇拉明以濃度依賴性方式顯著抑制了管的形成 ( Z'因子為 0.75 ) ( 圖 5 )。 這些結(jié)果與使用明場(chǎng)成像和手動(dòng)定量進(jìn)行的結(jié)果相當(dāng)，但是對(duì)于 96 孔板，測(cè)定時(shí)間從 8 小時(shí)大大減少到不到 30 分鐘。

圖 5 用蘇拉明處理的管長(zhǎng)百分比的濃度響應(yīng)曲線。 用 MetaXpress 軟件中的自定義模塊測(cè)量用 Calcein-AM( 綠點(diǎn) ) 或 Crystal Violet ( 紅色三角形 ) 染色的HUVEC 管。用 4 參數(shù)曲線擬合繪制總管長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)與蘇拉明濃度的關(guān)系圖，得出Calcein-AM 的 EC50 值為 15 μM，結(jié)晶紫的 EC50 值為 13 μM。 MIC ≥ 30％被評(píng)為顯著反應(yīng)。 圖表顯示三個(gè)或四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值 ± SEM，兩個(gè)重

結(jié)論
高通量篩選可實(shí)現(xiàn)多種管狀結(jié)構(gòu)形成應(yīng)用
血管形成實(shí)驗(yàn)可作為一種體外 3D 血管生成工具，用于選擇各種不同來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞、不同細(xì)胞類型的共培養(yǎng)、生長(zhǎng)培養(yǎng)基的替代補(bǔ)充劑、不同類型的支持基質(zhì)或?qū)Ω杉?xì)胞進(jìn)行血管生成誘導(dǎo)等實(shí)驗(yàn)6,8-10。然而，從圖像采集到處理和分析，擴(kuò)大血管形成實(shí)驗(yàn)的規(guī)模面臨巨大的挑戰(zhàn)。在這里，我們總結(jié)了一種優(yōu)化的 HUVEC 血管形成高通量定量分析，用于篩選抗血管生成化合物。通過(guò)熒光染色、z 層堆疊獲取、整孔圖像二維投影生成，以及采用獨(dú)特的圖像處理方法來(lái)定義小管和節(jié)點(diǎn)的自定義模塊，我們能夠?yàn)楣軤罹W(wǎng)絡(luò)提供可靠的自動(dòng)分析。通過(guò)自動(dòng)化成像和分析，避免了分析結(jié)果的偏差，徹底解決了人工或半自動(dòng)定量耗時(shí)的問(wèn)題。使用 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)可以簡(jiǎn)化程序，并使血管分析可靠，可重現(xiàn)且通量高。