概述
線粒體是細(xì)胞的主要能量來源，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝中起著重要作用。線粒體可以根據(jù)環(huán)境條件和細(xì)胞需求改變其結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)自身的形態(tài)，其動力學(xué)本質(zhì)是由分裂、融合、自噬和生物發(fā)生幾個過程驅(qū)動。線粒體分裂產(chǎn)生大量的圓形碎片，尺寸較??；融合產(chǎn)生的線粒體數(shù)量較少，形狀細(xì)長且尺寸較大。線粒體分裂和融合的相對過程都參與到線粒體質(zhì)量控制和正常細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持過程中 [2，3]。線粒體分裂和融合對細(xì)胞的正常功能都至關(guān)重要。
線粒體自噬是清除受損線粒體的過程，是正常線粒體循環(huán)的重要組成部分。線粒體受損或衰老時會發(fā)生不對稱裂變。當(dāng)
健康的成分被運送到新的線粒體時，受損的成分將被分離成小的組分，這些小的組分被去極化并通過線粒體自噬小體迅速清除 [4]。生物發(fā)生是導(dǎo)致新的線粒體成分合成的過程。線粒體動力學(xué)的病理改變可導(dǎo)致生物能量功能受損和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并與多種病理機制相關(guān)，包括缺血性心肌病，糖尿病，肺動脈高壓，帕金森氏病和亨廷頓氏病以及骨骼肌萎縮癥或阿爾茨海默氏病 [1,5]。由于線粒體本身有限的糖酵解能力和高水平的能量使用，神經(jīng)元對線粒體功能的改變特別敏感 [6]。心肌細(xì)胞是線粒體體積分?jǐn)?shù)Z高的細(xì)胞之一，對線粒體動態(tài)變化也特別敏感 [7,8]。線粒體動態(tài)改變在許多癌癥中也發(fā)揮作用，其中線粒體融合可以降低細(xì)胞對凋亡信號的敏感性，誘導(dǎo)有氧糖酵解 (Warburg 效應(yīng) )，并可能通過減少凋亡細(xì)胞死亡而促進(jìn)癌細(xì)胞生長 [9]。
主要特點
? 獲得高質(zhì)量的圖像，更好地顯示線粒體形狀和結(jié)構(gòu)的變化
? 以更有效、更精確的方式量化和測量線粒體的表型變化
? 了解疾病的機制并評估各種細(xì)胞模型中的化合物毒性

研究表明，線粒體動力學(xué)的改變可以促成應(yīng)急刺激的正常生理反應(yīng)。在運動期間，骨骼肌的線粒體碎片能維持活躍的體
內(nèi)平衡；恢復(fù)過程中，線粒體融合被激活，并維持穩(wěn)定。

目前，科研界對使用高內(nèi)涵成像方法研究線粒體結(jié)構(gòu)重塑的興趣日益濃厚。共聚焦成像和水鏡可以提高成像質(zhì)量并更好地顯示線粒體結(jié)構(gòu)，而這些圖像分析工具可以獲得不同表型的數(shù)字特征。本研究中，我們闡述了線粒體表型和結(jié)構(gòu)重排的分析模塊可用于線粒體動力學(xué)為基礎(chǔ)的細(xì)胞研究。
材料
PC12 ( 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 ) 獲自 ATCC，Hoechst 33342 和MitoTracker ( 橙色 ) CMTMRos 均從 Thermo Fisher 購買?；衔镔徸?Sigma。將 PC12 細(xì)胞以每孔 3,000 個細(xì)胞的密度接種 于 384 孔板(Greiner) 中。第二天，用不同濃度的化合物處理細(xì)胞 18 小時，包括氯喹 (0 – 100 μM)，魚藤酮 (0 – 10 μM)，纈氨霉素 (0 – 1 μM) 和甲基汞 (0 – 10 μM)。每種化合物均以七種不同濃度 ( 對數(shù)稀釋 ) 以四個復(fù)孔進(jìn)行測試，樣本大小為n=8。處理后，將活細(xì)胞用線粒體染料 Mitotracker OrangeCMTMRos 和 Hoechst 33342 核染料 ( 分別為 0.2 μM 和 0.5μM ) 染 色 30 分鐘，并用 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)(Molecular Devices) 成像。使用共聚焦模式和 40X 水鏡拍攝活細(xì)胞的圖像。每個孔取三到四個視野。為了獲取更好的檢測性能，用 Z 軸層掃的功能以 0.6-1 微米的間隔獲取 3-4 個圖像。用 DAPI 通道和 TRITC 通道分別在 100 毫秒和 400 毫秒的曝光下對細(xì)胞核和線粒體成像。使用 MetaXpress 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件中的自定義模塊編輯器分析圖像。( 詳細(xì)信息在結(jié)果部分中進(jìn)行了詳細(xì)描述 )。一般來說，使用“ 查找纖維 ”模塊來識別細(xì)長的線粒體，使用“ 顆粒度 ”模塊以獲得更多的圓形顆粒，識別出具體的計算對象后，使用 Excel或 SoftMax Pro Software 曲線擬合工具完成了二級分析。使用公式 Z ′ = 1-3 *(STDEVcontrol +STDEVexperiment)/(AVEcontrol- AVEexperiment) 計算 Z’值。
結(jié)果
表征線粒體的完整性和形狀對理解疾病機制和評估毒性很重要。線粒體的數(shù)量、亮度、大小、長度和形狀在線粒體循環(huán)過程中發(fā)生變化，可能預(yù)示著細(xì)胞健康和代謝的變化，或先于細(xì)胞凋亡的過程。我們將對照組 PC12 的線粒體表型與已知影響線粒體變化的化合物作用進(jìn)行了比較：氯喹能抑制線粒體循環(huán)，魚藤酮 ( 氧化磷酸化的抑制劑 ) 和纈氨霉素 ( 鉀離子載體 ) 會破壞線粒體膜電位。用不同濃度的化合物處理細(xì)胞，四個復(fù)孔，處理 18 小時并用 Mito Tracker Orange 和 Hoechst染料對細(xì)胞進(jìn)行染色。用 40X 的水鏡在共聚焦模式下對細(xì)胞成像，可以分辨單個線粒體并監(jiān)測線粒體形狀的變化。圖 1 和圖 2 顯示對照樣品和經(jīng)化合物處理的樣品的線粒體圖像。例如，注意圖 2 所示的線粒體表型的變化。對照組細(xì)胞的線粒體纖維延伸較長，纈氨霉素處理導(dǎo)致線粒體碎裂，呈小點狀，魚藤酮處理引起細(xì)胞核周圍線粒體破碎和凝結(jié)。重要的是，纈氨酸霉素和魚藤酮都引起線粒體電位的損失，表現(xiàn)為線 粒體熒 光強 度的降 低 ( 圖 2 )。肉眼 觀 察 氯 喹的作用不明顯，但 通 過圖像分析測定，形態(tài)發(fā)生了明顯變化 ( 見下表 )。我們觀察到化合物效應(yīng)的濃度依賴性 ( 圖 2 )。在較低濃度的化合物中，形態(tài)變化明顯。高濃度的化合物導(dǎo)致線粒體膜電位的損失、線粒體的破壞和細(xì)胞的程序性死亡。

圖 1 線粒體形狀的表型分析。 用 MitoTracker Orange 和 Hoechst 將 PC12 染色 15 分鐘，并使用 40X 水鏡以共聚焦模式成像。使用 MetaXpressCustom Module Editor 的 Granularity（A）和 Find Fibers（B）模塊分析圖像。 A. 細(xì)胞核顯示為藍(lán)色，完整的線粒體顯示為黃色。右側(cè)圖像白色顯示了用于細(xì)胞核和線粒體（ 顆粒 ）的模擬圖層。B. 黃色的線粒體圖像用圖像銳化算法（TOP-Hat）進(jìn)行了預(yù)處理。右側(cè)圖像顯示了“ 纖維 ”結(jié)構(gòu)的模擬圖層。

圖 2 化合物對線粒體的作用。 頂部窗口顯示了 MitoTracker CMTMRos 線粒體染色（ 黃色 ），用于對照 PC1（A），用 100 nM 已知可破壞線粒體結(jié)構(gòu)的化合物處理 18 小時：纈霉素（B）和魚藤酮（C）。使用具有共聚焦模式的 40X 水鏡和對細(xì)胞進(jìn)行成像。調(diào)整圖像的亮度，以更好地顯示線粒體。注意線粒體形狀的變化 : 纈氨霉素使線粒體線分裂成更小的顆粒，魚藤酮使線粒體纏繞和塌陷。使用 MetaXpress 自定義模塊編輯器分析圖像。底部窗口中的分析模擬圖層顯示了線粒體顆粒（ 粉紅色 ）和纖維結(jié)構(gòu)（ 黃色 ），核（ 深藍(lán)色 ）和細(xì)胞體（ 淺藍(lán)色 ）。

圖 3 用氯喹（ 可抑制線粒體再循環(huán) ），魚藤酮（ 氧化磷酸化抑制劑 ）和纈氨霉素（ 鉀離子載體，可破壞線粒體膜電位 ）處理 PC12 細(xì)胞。 用指定濃度的化合物處理細(xì)胞 18 小時，做四個復(fù)本。如圖 1 和 2 所示，對細(xì)胞進(jìn)行染色和成像。圖像分析將線粒體結(jié)構(gòu)確定為“ 纖維 ”( 頂部 ) 或“ 顆粒 ”( 中部 )。EC50 的值取決于四個濃度依賴性復(fù)本和參數(shù)曲線的擬合。附加圖表示線粒體染色后熒光強度的變化。綠色是氯喹，紅色是魚藤酮，藍(lán)色是纈氨霉素。
MetaXpress 軟件可以做形態(tài)測量。我們利用“ 定制模塊編輯器 ”查找和表征可以定義為“ 顆 粒 ”或“ 纖 維 ”的對
象。顆粒由“ 顆粒度 ”模塊定義；纖維結(jié)構(gòu)或段可以由“ 查找纖維 ”模塊確定。根據(jù)用戶應(yīng)用不同來定義對象，例如Z小或Z大寬度和局部背景的強度。圖像預(yù)處理 ( 銳化 ) 是可選步驟，可以 更 好的定 義 纖 維 ( 圖 1 )。MetaXpress 可以為每個對象定義數(shù)量、面積、強度、長度、和形狀，并以每個視野或每個圖像的形式表示為數(shù)值的平均值或總和 ( 圖 2 )。這些檢測結(jié)果可以用數(shù)字來表征線粒體結(jié)構(gòu)動力學(xué) ( 圖 4 )，以及計算劑量反應(yīng)和各種化合物的有效濃度 ( 圖 3 )。具體來說，用已知的有線粒體毒性的藥物處理細(xì)胞不僅導(dǎo)致線粒體電位降低 ( 檢測為線粒體包括顆粒和纖維的數(shù)量減少和熒光強度降低 )，而且還改變了總纖維長度和平均纖維長度，尤其是用纈氨霉素治療時更為明顯 ( 圖 4 )。與此同時，抑制線粒體循環(huán)的氯喹處理導(dǎo)致線粒體積聚，因此增加了纖維數(shù)量。表 2 比較了對照樣品和化合物處理樣品的不同測量值。給出了單個（ 中間 ）濃度的化合物的數(shù)據(jù)：20 μM 氯喹，300 nM魚藤酮和 100 nM 纈霉素。魚藤酮和纈氨霉素治療后，線粒體纖維的數(shù)量和長度出現(xiàn)明顯的劑量依賴性降低，而氯喹則產(chǎn)生相反的作用。通過粒度分析，可以確定纈氨霉素和魚藤酮減小了顆粒數(shù)量和面積。該方法可以獲得各種測量值，并且這種多參數(shù)方法可用于定義信號傳導(dǎo)途徑對復(fù)雜生物發(fā)生多方面的影響。

在分析過程中，我們比較了水鏡和空氣鏡對圖像質(zhì)量和分析的影響。值得注意的是，使用水鏡可以提高圖像質(zhì)量，并且通常會導(dǎo)致 Z' 值增加（ 表 3 ）。本分析在纖維和顆粒之間并非是排他性的，因此，推薦對纖維和顆粒進(jìn)行獨立計數(shù)。圖 4 中顯示了所使用的定制模塊的描述。可以針對特定的細(xì)胞類型或疾病模型進(jìn)行調(diào)整和進(jìn)一步修改。

圖 4 自定義模塊編輯器 (CME)。 用自定義模塊編輯對線粒體表型進(jìn)行計數(shù)和分析，以評估線粒體的健康、代謝、循環(huán)、復(fù)合效應(yīng)和疾病狀態(tài)的含義。
該模塊包括以下步驟 :
1. 粒度模塊用于檢測線粒體顆粒。
2. 用 Top hat 算法預(yù)處理線粒體圖像。
3. 用 find fibers 模塊，檢測線粒體粒子及其裂變和聚變。
4. 單閾值檢測細(xì)胞個體。
應(yīng)用 CME 可以識別每個對象的特定參數(shù)來確定每個圖像或每個區(qū)域的對象總和。相關(guān)的檢 測取決于具體的應(yīng)用。Z常用的檢 測指標(biāo)如下 :
1. 細(xì)胞核計數(shù) ( 細(xì)胞計數(shù) )
2. 核平均區(qū)域 / 平均強度
3. 總顆粒數(shù) ( 每個視野 )
4. 細(xì)胞顆粒數(shù) ( 每個細(xì)胞 )
5. 顆粒面積，平均顆粒面積，顆粒光強度或整體顆粒光強度
6. 總纖維量 ( 每張圖像 )
7. 細(xì)胞纖維量 ( 每個細(xì)胞 )
8. 平均纖維長度，纖維長度和纖維光強度

結(jié)論
本研究闡述了使用高內(nèi)涵成像和高級圖像分析的線粒體動力學(xué)分析方法，該方法能夠量化線粒體的表型變化，并且可以用于研究正常和病理結(jié)構(gòu)變化以表征疾病模型或復(fù)合效應(yīng)。自動成像可適用于各種細(xì)胞模型中化合物的藥物開發(fā)或毒性評估。