簡介
作為新冠病毒免疫反應的一部分，感染者體內會產(chǎn)生病毒特異性抗體，在出現(xiàn)癥狀后的一至三周內，這些抗體可以在血液中被檢測到。IgG 和 IgM 幾乎同時出現(xiàn)，而 IgG 在更長時間內維持一個高水平。在血清中，由于感染病毒或接種疫苗而產(chǎn)生的可檢測到的抗體可以防范將來被新冠病毒感染。但這些抗體持續(xù)的時間長短和提供保護的程度是有關新冠病毒仍需密切調查的眾多問題之一。
在人體血清中，通過免疫實驗來檢測新冠抗體是增進我們了解這種疾病以及疫苗研究的重要工具。Promega LumitTM
Dx SARS-CoV-2 免疫實驗使用了帶有 SmBiT 和 LgBiT ( 這是 NanoLuc 熒光素酶的兩個亞基，只有當它們通過結合相互靠近時，才具有功能 ) 標記的新冠病毒刺突蛋白受體結合區(qū)域(RBD) 的一個片段。當這些標記過的病毒蛋白片段與含有新冠病毒抗體的樣品一起孵育時，他們將與抗體結合，將 SmBiT和 LgBiT 兩個亞基結合到一起，并產(chǎn)生功能性的熒光素酶。添加 Lumit 檢測試劑，在微孔板光度計上測量產(chǎn)生的熒光信號。
Lumit 實驗中，樣品的添加和測讀如圖 1 所示。沒有清洗的步驟并且一小時內測得結果，使得這個實驗可以應用于高通
量篩選。SpectraMax iD5 多功能酶標儀具有超冷光電倍增管(PMT)，可以為 Lumit Dx 新冠病毒免疫實驗提供高靈敏度的發(fā)光檢測。

優(yōu)點
? 放大高通量篩選，省去清洗步驟，
? 樣品體積僅需 15 微升，
? 一小時內測得結果。

材料
? Lumit Dx 新冠病毒免疫實驗試劑盒 (Promega cat. #VB1080)
? 新冠病毒陽性血清樣品 (BioIVT cat. #HMSRM-COVID)
? 正常人血清 (Amsbio cat. #HSER-2mL)
? 白色 96 孔板 (Greiner cat. #655075)
? SpectraMax iD5 多功能酶標儀 ( 美谷分子儀器 )
方法
實驗試劑的準備和微孔板的操作如下 ( 更多的細節(jié)， 請參閱Lumit Dx 新冠病毒免疫實驗技術手冊 )：
1. 制備 1x Lumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液 ( 添 加 5mL 10xLumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液 至 45 mL Lumit-Dx PBS/
EGTA 溶液中 )。
2. 來源于新冠患者或健康受試者的 30 uL 血清樣本， 與 70 uL1x Lumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液混合。 有足夠的體積進行三次實驗； 通常每個孔僅需 15 uL 樣品。
3. Lumit-Dx CoV-2 BiTs Master Mix 現(xiàn) 配 現(xiàn) 用， 配 方 如 下：5mL 1x Lumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液、9.4 uL Lumit-DxCoV-2 LgBiT( 紅色蓋子 )、9.4 uL Lumit-Dx CoV-2 SmBiT( 藍色蓋子 )。 添加完畢后， 輕微地顛倒混勻。
4. Lumit-Dx 陽性對照、Lumit-Dx 陰性對照、Lumit-Dx 實驗校準試劑， 解凍后放置于室溫及時使用。 簡短的離心可使管壁內容物甩至管底。

5. 按如下操作， 添加試劑至白色 96 孔板中：
? 每個孔加入 40uL Lumit CoV-2 BiTs Master Mix，
? 20uL 稀釋的病人血清樣本， 三個重復，
? 20uL Lumit-Dx 陽性對照， 三個重復，
? 20uL Lumit-Dx 陰性對照， 三個重復，
? 20uL Lumit-Dx 實驗校準試劑， 三個重復，
6. 將微孔板封蓋， 室溫孵育 20 分鐘。
7. 孵育后， 制備 Lumit-Dx 檢測試劑 (7mL 1x Lumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液、230 uL Lumit-Dx 檢測底物 ( 灰色蓋子 )，現(xiàn)配現(xiàn)用。 輕微地顛倒混勻。
8. 60 uL 檢測試劑加入孔中， 室溫孵育 3 分鐘。
9. 使用 SpectraMax iD5 讀板機測讀， 如表 1 所設置。 測讀完成后， 相對發(fā)光單位 (RLUs) 顯示在 SoftMax Pro 軟件的plate 板塊中。 在模板中， 這些孔被分配到不同的組中，各組產(chǎn)生的表單被用于計算和顯示數(shù)據(jù)結果。實驗的質控按照試劑盒技術手冊進行評估。 Lumit-Dx 實驗校準試劑、Lumit-Dx 陽性對照、Lumit-Dx 陰性對照都被用于確保Z合適的實驗性能。 相比于 Lumit-Dx 實驗校準試劑， 陽性對照必須產(chǎn)生更高的相對發(fā)光單位值， 陰性對照必須產(chǎn)生更低的相對發(fā)光單位值。 如果這些條件不滿足， 微孔板測讀結果將是無效的。