介紹
自噬及其失調(diào)已被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)退行性疾病和癌癥中發(fā)揮重要作用，因此在這一過程中發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)已成為一種有前途的藥物治療方法。自噬是在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中降解和循環(huán)受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的調(diào)節(jié)過程 1,2 。這種被稱為自噬體的囊泡是通過在標(biāo)記為破壞的細(xì)胞成分周圍形成雙膜來組裝的 1 。然后自噬小體囊泡與溶酶體融合，將其內(nèi)容物通過溶酶體水解酶降解。自噬具有多種復(fù)雜的生理和病理生理作用，如對營養(yǎng)饑餓的適應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器受損的清除、細(xì)胞發(fā)育、抗衰老、微生物清除、細(xì)胞死亡、腫瘤抑制和抗原呈遞等 2 。線粒體自噬是線粒體自噬的選擇性降解。這個(gè)過程經(jīng)常消除細(xì)胞損傷或應(yīng)激后線粒體缺陷。
材料
? PC12 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系 (ATCC)
? 384-孔微孔板 (Greiner)
? Cyto-ID? 自噬檢測試劑盒(ENZO Life Sciences)
? MitoTracker Orange(ThermoFisher Scientific)
? Hoechst (ThermoFisher Scientific)
? ImageXpress? Pico 個(gè)人型高內(nèi)涵成像系統(tǒng)(Molecular Devices)
? CellReporterXpress? 自動(dòng)成像分析軟件(Molecular Devices)

方法
本文中，我們評估了 ImageXpress Pico 個(gè)人型高內(nèi)涵成像系統(tǒng)檢測和定量分析自噬體粒子的效率。以 PC12 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系為模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。在 6,000 個(gè)細(xì)胞/孔的條件下，將細(xì)胞種在 384 孔板中，孵育 48 小時(shí)，通過不同濃度的氯喹或維拉帕米處理細(xì)胞，評估自噬作用 48 小時(shí)，維拉帕米誘導(dǎo)自噬，氯喹抑制自噬體降解，導(dǎo)致粒子積累。治療后，使用細(xì)胞自噬檢測試劑盒對活細(xì)胞進(jìn)行染色，追蹤自噬小體。此外，MitoTracker Orange染料用于檢測線粒體和 Hoechst 確定核 ( 分別為 0.2 μM 和 1 μM )。使用 ImageXpressPico 系統(tǒng)的 20x 或 40x 物鏡和三個(gè)檢測相應(yīng)染料的通道 ( FITC、TRITC 和 DAPI ) 拍攝圖像。每孔在 20x 物鏡下獲得一張圖像，而每孔在 40x 物鏡下獲得 2 - 4 張圖像，以確保可靠的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。使用 CellReporter Xpress 圖像采集和分析軟件中的自噬或線粒體應(yīng)用模塊對圖像進(jìn)行分析。該算法利用核標(biāo)記物對細(xì)胞進(jìn)行分割，檢測和表征細(xì)胞胞質(zhì)中的自噬小體或線粒體等小物體。檢測自噬的定量測量包括顆?？偭炕蚱骄鶖?shù)量、顆?？偭炕蚱骄娣e ( 亞細(xì)胞物體 ) 以及熒光強(qiáng)度測量。代表性的圖像和分析標(biāo)識(shí)氯喹 (30 μM) 處理的細(xì)胞如圖1 所示。檢測氯喹和維拉帕米的濃度反應(yīng)，并評價(jià) EC50 值。氯喹和維拉帕米處理后自噬水平分別增加了 4.6 和 3.3 倍，由總自噬小體的數(shù)量來計(jì)算 ( EC50 值分別為 4.0和 3.6 μM )。

優(yōu)勢
? 量化自噬過程中的化合物效應(yīng)
? 使用核標(biāo)記對細(xì)胞進(jìn)行分割時(shí)，檢測和表征小型目標(biāo)物
? 使用自動(dòng)化成像分析確?？煽康慕y(tǒng)計(jì)結(jié)果

結(jié)論
該方法可用于檢測自噬顆粒，可用于檢測化合物對自噬過程的影響。