介紹
在生物實(shí)驗(yàn)中要經(jīng)常要使用到的平行線(xiàn)分析 (PLA) 方法，當(dāng)無(wú)法直接檢測(cè)一個(gè)生物制品的活性而只能通過(guò)檢測(cè)其產(chǎn)生的效果時(shí)， PLA方法通常會(huì)被用來(lái)進(jìn)行效應(yīng)曲線(xiàn)的比較來(lái)獲得此制品的效果 (Figure1) 。如果對(duì)于兩種物質(zhì)其生物響應(yīng)相似或者在兩種不同的生物環(huán)境中同一種物質(zhì)產(chǎn)生相似的效應(yīng)曲線(xiàn)時(shí)，平行線(xiàn)分析法可以被用來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)平行性是計(jì)算化合物或藥物相對(duì)活性的前提，并且在很多生物應(yīng)用中如藥物活性比較、分析物鑒定、交叉反應(yīng)、干擾物質(zhì)、基質(zhì)補(bǔ)償、濃度估算和抑制效應(yīng)等應(yīng)用研究中。
當(dāng)兩條曲線(xiàn)被判定為平行時(shí)，其中一條曲線(xiàn)的函數(shù)可以通過(guò)通過(guò)另一條曲線(xiàn)的函數(shù)乘上一個(gè)比例系數(shù)向X軸的左邊或右邊變換獲得： ? (x) = ? (rx)，其中 x 是劑量，r 是比例系數(shù)或相對(duì)活性。對(duì)于相對(duì)活性，一般將參考品 ( 已知品 ) 的活性設(shè)為 1，可以使用一個(gè)比例系數(shù)可以將參考品的曲線(xiàn)變換為測(cè)試品 ( 未知品 ) 曲線(xiàn)，那么這比例系數(shù)則被稱(chēng)之為測(cè)試品的相對(duì)活性。這個(gè)方法應(yīng)用于線(xiàn)性擬合的曲線(xiàn)非常合適，因?yàn)榫€(xiàn)性擬合的曲線(xiàn)在整個(gè)濃度范圍內(nèi)的曲線(xiàn)斜率是保持一致的 (Figure2)。可是對(duì)于非線(xiàn)性擬合曲線(xiàn)如 4- 參數(shù)和 5- 參數(shù)曲線(xiàn)，S形的濃度效應(yīng)曲線(xiàn)在整個(gè)測(cè)試濃度范圍內(nèi)具有變化的斜率值 (Figure1)。

用于評(píng)價(jià)平行性的方法根據(jù)平行性假設(shè)的驗(yàn)證方法不同大致可以分為兩大類(lèi)：效應(yīng)比較法和參數(shù)比較法。本文將對(duì)這兩大類(lèi)方法進(jìn)行詳細(xì)解釋和介紹怎樣使用SoftMaxPro 7 軟件進(jìn)行平行性測(cè)試。我們建立了一個(gè) Protocol 包括了使用 F- 檢驗(yàn)進(jìn)行 F- 檢驗(yàn)概率測(cè)試和使用卡芳-檢驗(yàn)進(jìn)行卡芳概率測(cè)試。另外，對(duì)于參數(shù)比較法，根據(jù)菲勒定理我們也建立了一 個(gè)Parallelism Test 的 protocol 放在 SoftMaxPro Protocol 的庫(kù)內(nèi)。所有這些方法都可以被用于評(píng)價(jià)線(xiàn)性和非線(xiàn)性擬合曲線(xiàn)。

平行性檢測(cè)
生物系統(tǒng)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)不符合預(yù)期的現(xiàn)象，并且數(shù)據(jù)會(huì)出現(xiàn)一些噪聲和波動(dòng)；因此，選擇正確的曲線(xiàn)擬合方式和權(quán)重因子，來(lái)消除這些噪聲和波動(dòng)是進(jìn)行平行性評(píng)價(jià)前的S要一步。如果選擇了一個(gè)不合適的擬合方式，那么可能在平行性評(píng)價(jià)系統(tǒng)內(nèi)引入偏差，進(jìn)而得出錯(cuò)誤的結(jié)論。由于根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)，很難獲得完全平行的擬合曲線(xiàn)，尤其對(duì)于非線(xiàn)性擬合回歸，而計(jì)算非平行曲線(xiàn)獲得相對(duì)活性是很困難的。在效應(yīng)比較法中，參考品和測(cè)試品的曲線(xiàn)會(huì)使用約束模型同時(shí)進(jìn)行擬合，在這個(gè)模型中，曲線(xiàn)被強(qiáng)制變?yōu)槠叫校欢诜羌s束模型中，兩條曲線(xiàn)會(huì)各自進(jìn)行擬合。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，來(lái)比較約束模型和非約束模型兩種擬合度的差異，這個(gè)差異可能是由于非平行性造成的。
在約束模型中，用來(lái)描述曲線(xiàn)的所有參數(shù)都是一樣的，除了用來(lái)描述 X- 值的參數(shù)不一樣；線(xiàn)性擬合中，X- 值是指截距，非線(xiàn)性擬合中是指上、下漸近線(xiàn)之間的中值，也就是 EC50 值。SoftMax Pro 軟件具有計(jì)算線(xiàn)性擬合的相對(duì)活性，也可以使用約束性模型 ( 全局?jǐn)M合模型 ) 和獨(dú)立模型對(duì)非線(xiàn)性擬合曲線(xiàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)和計(jì)算相對(duì)活性。

? ChiSquaredPLA (PlotName@GraphName): 返回被擬合曲線(xiàn)的卡芳統(tǒng)計(jì)值
? ChiProbabilityPLA (PlotName@GraphSection): 返回被擬合曲線(xiàn)的卡芳統(tǒng)計(jì)值
概率分布值
? FStatPLA (PlotName@GraphSection):返回被擬合曲線(xiàn)的 F- 檢驗(yàn)值
? FProbPLA (PlotName@GraphSection):返回被擬合曲線(xiàn)的 F- 檢驗(yàn)值概率分布值
注：以上所有公式只有在曲線(xiàn)擬合選項(xiàng)置中的 Global Fit (PLA) 選項(xiàng)被使用的情況下才可以使用。PlotName@ GraphName 是曲線(xiàn)的全稱(chēng)，包含圖表的名稱(chēng)，例如，Plot#1@Graph#1 或 Std@Standardcurve。指定某一條曲線(xiàn)作為公式內(nèi)曲線(xiàn)是帶有主觀(guān)性的，實(shí)際上卡方值是從該圖表中的所有曲線(xiàn)數(shù)據(jù)計(jì)算而來(lái)的。名稱(chēng)為“Parallel Line Analysis Using Ftest and Chi-squared Test”的模板，是根據(jù)這兩種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法而建立的 SMP 模板。當(dāng)使用儀器直接獲取到數(shù)據(jù)或者從外部導(dǎo)入數(shù)據(jù)到模板中后，所有的計(jì)算過(guò)程會(huì)自動(dòng)進(jìn)行，并進(jìn)行零假設(shè)的評(píng)估，判斷曲線(xiàn)是否平行。
在這個(gè)模板中， F- 檢驗(yàn)和卡芳檢驗(yàn)的概率值必須大于等于 0.05 才能認(rèn)定曲線(xiàn)是平行的。一般來(lái)說(shuō)，這個(gè)設(shè)置的意思是指有95% 的置信度該假設(shè)是成立的。置信程度是可以被調(diào)整的以適應(yīng)不同實(shí)驗(yàn)的接受水平。

虛假設(shè)測(cè)試
在效應(yīng)比較法中，平行性的計(jì)算通常是利用殘差平方和 (RSSE) 的函數(shù)來(lái)進(jìn)行的,以此來(lái)判斷約束性模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合效果，另外一個(gè)特殊的方法，則是根據(jù)附加平方和的分析來(lái)進(jìn)行。這個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)回歸方法是方差分析 (ANOVA) 的一種形式，其中虛假設(shè)的是約束性模型是正確的或者說(shuō)曲線(xiàn)是相互平行的。虛假設(shè)的驗(yàn)證，可以使用各種不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)技術(shù)，包括概率的 F- 檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。在這兩種方法中，概率值會(huì)被計(jì)算出來(lái)，通常這個(gè)值介于 0-1 之間，當(dāng)這個(gè)值接近 1 時(shí)，意味著曲線(xiàn)間的平行性在增大。需要注意的是，F(xiàn)- 檢驗(yàn)是有一定缺陷的，此法對(duì)于對(duì)獨(dú)立模型擬合度很高的曲線(xiàn)可能產(chǎn)生假陽(yáng)性判斷或者對(duì)于獨(dú)立模型擬合度很低的曲線(xiàn)產(chǎn)生假陰性的判斷。這兩種方法都被收錄進(jìn)了 SoftMax Pro 軟
件當(dāng)中，檢驗(yàn)值和概率值計(jì)算可以通過(guò)軟件內(nèi)的以下公式方便的獲得：

噪聲和權(quán)重
噪聲是指檢測(cè)響應(yīng)的隨機(jī)變化，當(dāng)進(jìn)行平行線(xiàn)評(píng)價(jià)時(shí)這是需要考慮的重要因素，因?yàn)樗鼤?huì)影響檢測(cè)平行性的能力。在高噪聲的情況下，平行性計(jì)算值由于由于受噪聲的影響過(guò)大，因此無(wú)法再正確地反應(yīng)非平行性的程度。
對(duì)于 F- 檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)法這兩種方法，在計(jì)算各自的概率值的過(guò)程中對(duì)于不同噪聲水平的處理能力是不同的。F- 檢驗(yàn)的概率值不受此因素影響，但是卡芳檢驗(yàn)概率計(jì)算值則高度依賴(lài)于噪聲水平并要求對(duì)于數(shù)據(jù)方差進(jìn)行準(zhǔn)確的估算。因此，對(duì)于卡方檢驗(yàn)法需要進(jìn)行反方差權(quán)重設(shè)置。如在“Selecting the best weightingfactor in SoftMax Pro 7”此篇應(yīng)用資料里討論的，生物實(shí)驗(yàn)一般在在曲線(xiàn)的上半部分會(huì)有較大的方差。在無(wú)權(quán)重的回歸分析中，平行性的結(jié)果會(huì)主要受曲線(xiàn)的上半部分的數(shù)據(jù)點(diǎn)影響，而曲線(xiàn)的下半部分的數(shù)據(jù)點(diǎn)在對(duì)于平行性結(jié)果的影響不大。在軟件的模板中，權(quán)重因子的設(shè)置使用方差的倒數(shù)，但是根據(jù)情況可以調(diào)整為更合適的權(quán)重公式。另外，在 SoftMax Pro 6.5或更高版本中，可以直接進(jìn)行方差的倒數(shù)權(quán)重項(xiàng)的設(shè)置 (Figure 4G)。卡方檢驗(yàn)方法中，參數(shù)的置信區(qū)間設(shè)置項(xiàng) (Figure 4H) 只有在‘Weights are Inverse Variances’項(xiàng)被選擇的情況下才能使用。更合適的權(quán)重因子的設(shè)置會(huì)保證結(jié)果是主要來(lái)源于所有變化的數(shù)據(jù)點(diǎn)。

如何在SoftMax Pro使用PLA在 SoftMax Pro 7 軟件中，PLA 可以在除了“point-to-point”,“l(fā)og-logit”和“cubic spline”三種擬合方式之外的所有通用曲線(xiàn)擬合方式下使用。在圖表部分，所有曲線(xiàn)具有一個(gè)共同的曲線(xiàn)擬合方程，PLA 的具體使用設(shè)置請(qǐng)見(jiàn) Figure 4。
參數(shù)比較法
與響應(yīng)比較法直接評(píng)價(jià)不同劑量曲線(xiàn)下的響應(yīng)差異不同，參數(shù)比較法會(huì)各自獨(dú)立地對(duì)非約束模型下的各個(gè)曲線(xiàn)的參數(shù)進(jìn)行比較，并參考大概置信區(qū)間；參數(shù)對(duì)必須落在規(guī)定置信水平下的置信區(qū)間內(nèi)。這種方法叫做等效測(cè)試和平行性小于規(guī)定閾值的測(cè)試法。歐洲藥典中使用的斜率比值法就是等效測(cè)試法的一個(gè)例子。
菲勒定理
菲勒定理使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算兩個(gè)參數(shù)比值的置信區(qū)間，使用 tInv 函數(shù)進(jìn)行比值的計(jì)算，因此遵循帶自由度的 t- 分布，其概率為 p。SoftMax Pro 軟件的統(tǒng)計(jì)學(xué)公式，可以計(jì)算參考曲線(xiàn)和測(cè)試曲線(xiàn)各自曲線(xiàn)擬合參數(shù)之間比值的置信區(qū)間，并建立了一個(gè)模板 (Figure 5) 包含了這些計(jì)算和概率閾值設(shè)定 0.1 ( 90% 置信度 )，可做相應(yīng)調(diào)整。為了判定參考曲線(xiàn)和測(cè)試曲線(xiàn)之間是否平行，需要將計(jì)算的置信區(qū)間與一定置信水平的固定置信區(qū)間進(jìn)行比較；在此模板中，使用 90% 的置信水平，因此，計(jì)算的置信區(qū)間如果落在 0.9~1.1 之間，那么這兩曲線(xiàn)將被認(rèn)定為平行。

Figure 4. 如何在 SoftMax Pro 軟件中應(yīng)用 PLA 和進(jìn)行相對(duì)活性計(jì)算。 選擇一個(gè)包含多個(gè)曲線(xiàn)的圖表，點(diǎn)擊 home 欄圖表工具中的曲線(xiàn)擬合設(shè)置項(xiàng) (A)；或者在圖表部分的上部的工具了項(xiàng) (B)；在曲線(xiàn)擬合項(xiàng)對(duì)話(huà)框內(nèi)選擇 Global Fit (PLA) 項(xiàng) (C)；在擬合下拉菜單內(nèi)選擇除 point-to-point, log-logit, 和cubic spline 三種擬合方式之外的任何擬合方式 (D)；選擇一條曲線(xiàn)作為參考曲線(xiàn) (E)；如有必要的話(huà)，選擇相應(yīng)的擬合參數(shù)和相對(duì)活性的置信區(qū)間 (F)；如有必要，選擇相應(yīng)的權(quán)重項(xiàng)，請(qǐng)參考“Selecting the best weighting factor in SoftMax Pro 7”中的關(guān)于如何在 SoftMax Pro V 版本 6.5 或更高版本中選擇方差倒數(shù)作為權(quán)重因子的設(shè)置方法 (G)；如有必要，選擇統(tǒng)計(jì)學(xué)工具按鈕 (H)；當(dāng)所有曲線(xiàn)選項(xiàng)設(shè)置好后，點(diǎn)擊 OK 按鈕，曲線(xiàn)會(huì)自動(dòng)被擬合到約束型模型中，除了描述X軸的參數(shù)外，描述各條曲線(xiàn)的參數(shù)是相同的如 Figure 3. 對(duì)于非線(xiàn)性擬合函數(shù)，所有曲線(xiàn)的Z小和Z大響應(yīng)值 ( 下平臺(tái)和上平臺(tái)值 )也被約束為相同的值。

對(duì)于線(xiàn)性擬合曲線(xiàn)，該測(cè)試會(huì)針對(duì)參考曲線(xiàn)和測(cè)試曲線(xiàn)的斜率值進(jìn)行，也即 SoftMaxPro 軟件中所描述的曲線(xiàn)方程內(nèi)的 B 參數(shù)值?？墒牵瑢?duì)于非線(xiàn)性擬合曲線(xiàn)，此方法只測(cè)試上平臺(tái)和斜率值，下平臺(tái)則由于菲勒定理的數(shù)學(xué)局限而不做測(cè)試。在低濃度時(shí)，參數(shù)的變異會(huì)非常高，導(dǎo)致中間計(jì)算過(guò)程會(huì)產(chǎn)生虛數(shù)，進(jìn)而導(dǎo)致Z終計(jì)算的置信區(qū)間不正確或無(wú)法計(jì)
算。這個(gè)問(wèn)題被美國(guó)農(nóng)業(yè)部 (USDA) 的獸用生物制品中心建議將下平臺(tái)值固定為 0，然后使用上平臺(tái)和斜率值來(lái)進(jìn)行測(cè)試。相同地，SoftMax Pro 軟件的 Parallelism Test 的模板內(nèi)，默認(rèn)將下平臺(tái)值設(shè)為 0，然后對(duì)斜率( 參數(shù)B ) 和作為上平臺(tái)的參數(shù) A 或 D 進(jìn)行平行性結(jié)論的判斷。

結(jié)論
眾多的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)都需要兩條劑量效應(yīng)曲線(xiàn)對(duì)的平行性進(jìn)行判斷，本應(yīng)用文章介紹了如何使用 F- 檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)的效應(yīng)比較法以及費(fèi)勒定理描述的參數(shù)比較法進(jìn)行平行線(xiàn)分析。SoftMax Pro 7 軟件中，可以選擇使用約束性和非約束性曲線(xiàn)擬合模型以及高級(jí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)公式計(jì)算分 析。同時(shí)SoftMax Pro 7 軟件中，還提供預(yù)存的建立好的每種方法的模板供用戶(hù)調(diào)用，輕松進(jìn)行本來(lái)很復(fù)雜的平行線(xiàn)分析。