介紹
在生物研究和藥物發(fā)現(xiàn)中，細胞檢測方法的多樣性和復雜性日益增加。干細胞來源的細胞和組織在藥物開發(fā)和毒理學安全性評估方面，已成為傳統(tǒng)體內(nèi)外試驗的一個越來越有吸引力的替代方法。在這項研究中，我們使用人類誘導多能干細胞 (iPSC)衍生的心肌細胞來開發(fā)功能和形態(tài)學讀數(shù)，以多參數(shù)檢測形式測試不同化合物的效果。
我們使用 ImageXpress Pico 個人型高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)對 ipsc 衍生的心肌細胞進行了自動細胞成像和分析，以同時確定鈣振蕩頻率、細胞存活率、細胞骨架完整性、凋亡和線粒體功能。通過鈣離子振蕩測定，研究了鈣離子振蕩對心肌細胞搏動頻率的影響。對不同類型記錄結果的多參數(shù)聯(lián)合評估提供了對各種化合物作用機制的進一步了解。這些方法使用一組已知的心臟活性藥物和選定的心臟毒性化合物進行了表征。用于化合物篩選的干細胞衍生細胞模型干細胞來源的心肌細胞，以及肝細胞和神經(jīng)元，為化合物測試和毒性評估提供了非常有用的模型。心臟毒性仍然是臨床試驗中藥物應用障礙的主要原因之一。此外，據(jù)報道很大比例的心血管疾病是由于環(huán)境暴露造成的。因此體外篩選潛在毒副作用的試驗開發(fā)是一個重要的研究領域。

方法
儀器
使用 ImageXpressPico 系統(tǒng)結合CellReporterXpress? 圖像采集和分析軟件進行基于細胞的檢測。該成像儀器提供
四個熒光通道、透射光和延時功能，能夠自動監(jiān)測活細胞中的復雜生物反應。

環(huán)境控制和延時監(jiān)測
ImageXpress Pico 系統(tǒng)配備了一個環(huán)境控制室，可以控制和監(jiān)控溫度、二氧化碳和氧氣含量以及濕度。該系統(tǒng)與延時成像相結合，是在正?；蛉毖鯒l件下進行活細胞實驗的有效工具。

優(yōu)勢
? 使用活細胞自動監(jiān)測復雜的生物反應
? 監(jiān)測鈣離子振蕩、形態(tài)變化和化合物的細胞毒性作用
? 可靠地重現(xiàn)藥物相關的心臟生理表型

細胞培養(yǎng)
人 ipsc 來源的心肌細胞和合適的培養(yǎng)基購自細胞動力學國際公司 (Cellular DynamicsInternational, Fujifilm Co.(CDI))。細胞被鋪在 384 孔的黑色透明底板上，密度為每孔 10000 個細胞，按照 CDI 推薦的方案進行培養(yǎng)?；衔锾幚?24 h。

細胞染色
為了觀察 Ca2+ 振蕩，細胞加載了 EarlyTox?心臟毒性試劑盒 (Molecular Devices)。為了評估表型變化，使用三種染料的混合物對活細胞進行
染色：活力染料 Calcein AM (1 μM)、線粒體膜電位染料 MitoTracker Orange (0.2μM) 和核染料 Hoechst (2μm) ( 均來自Life Technologies )。為了觀察肌動蛋白細胞骨架，我們用 4% 甲醛 (Sigma) 固定細胞，并用 AlexaFluor 488 (AF488) 標記鬼筆環(huán)肽染色。

評估化合物對心肌細胞鈣振蕩的影響
ipsc 來源的心肌細胞是一個非常有吸引力的體外模型。它們形成一個同步跳動的單層膜，可以使用快速、動態(tài)熒光檢測細胞內(nèi)鈣離子振蕩的變化，可靠地重現(xiàn)藥物相關的心臟生理學表型 (Grimm et al. 2016;Sirenko et al. 2013)。在本研究中，我們將鈣振蕩法應用于將延時成像與環(huán)境控制相結合的 ImageXpress Pico 系統(tǒng)。
利用透射光成像可以觀察到心肌細胞自發(fā)收縮和生理運動 。利用環(huán)境控制 ，在ImageXpress Pico 系統(tǒng)上對細胞內(nèi) Ca2+ 流進行熒光成像，每隔 0.5 秒采集一次圖像。用鈣染料加載細胞后，觀察到與機械收縮一致的熒光強度波動。圖 1A 為鈣染色心肌細胞延時采集的圖像 ( EarlyTox 心臟毒性試劑盒 )
利用細胞計數(shù)模塊對圖像進行分析，檢測細胞并測量平均熒光強度和平均細胞面積。通過繪制熒光強度隨時間的變化，可以觀察到鈣的振蕩。為了評估心肌細胞的毒性作用，我們對心肌細胞進行化合物處理，通常處理 24 小時。圖 1B 和圖 1C 顯示了添加測試化合物后產(chǎn)生的鈣振蕩痕跡的各種例子。圖 1B 顯示了以劑量依賴的方式 ( 濃度變化半對數(shù) ) 測試六種代表性化合物的實驗截圖。 圖 1C 顯示了對照、阿霉素和醋酸氟卡尼條件下代表性的放大痕跡。注意阿霉素對鈣流的抑制作用和氟卡尼醋酸處理后的鈣流延長的效應。

圖 1 測量 iPSC 心肌細胞 Ca2+ 振蕩。 為了測量 Ca2+ 振蕩，iPSC 使用 EarlyTox 心臟毒性試劑盒對心肌細胞進行染色，然后使用 ImageXpress Pico 系統(tǒng)在 FITC 通道中隨時間成像。 (A) 上面板顯示一系列圖像，每隔 0.5 秒采集一次。 (B) 所示化合物濃度增加時鈣振蕩的痕跡。 (C) 信號痕跡對比對照( 0.1% DMSO，黃色 )、阿霉素 ( 1mm，藍色 ) 或醋酸氟卡尼 ( 1mm，紫色 ) 處理。

通過復合處理，觀察了鈣振蕩頻率、振幅和峰形的變化。峰的數(shù)量是手工計算的。使用 SoftMax Pro 軟件評估重復時的峰值計數(shù)，并繪制濃度依賴關系圖 ( 圖 2 )。通過 4 參數(shù)曲線擬合計算抑制振蕩頻率的 EC50值。

圖 2 使用 4 參數(shù)曲線擬合，根據(jù)化合物濃度繪制峰數(shù) ( 手動計數(shù) )。 EC 值采用 SoftMax? Pro 軟件計算。西沙必利 ( 紫色 )、氟哌啶醇 ( 紅色 )、星孢菌素 ( 藍色 )、伊馬替尼 ( 黃色 )、阿霉素 ( 深綠色 )、醋酸氟卡尼 ( 綠色 ) 處理的峰值計數(shù)呈劑量依賴性下降。

評估化合物對細胞活力和形態(tài)學的影響
評價跳動曲線的變化對于檢測功能效應是重要的，同時成像還提供了監(jiān)測化合物的形態(tài)變化和細胞毒性效應的必要的補充檢測。成像和分析提供重要工具描述多個方面的結果包括細胞的生存能力,細胞形狀特征,細胞貼附和擴散，細胞骨架完整性和線粒體膜電位。
使用活細胞染色法，可以一步加入三種染料的混合物，無需固定細胞或重復清洗步驟。Calcein AM 被用來鑒定活的、代謝活躍的細胞，并染色整個細胞的形態(tài)學特征。使用可透的核染料 Hoechst 測量總細胞計數(shù)，評價細胞核形態(tài)。
MitoTracker 橙色是用來檢測細胞完整線粒體和測量測試化合物對線粒體的影響潛力。化合物孵育 24 小時后染色。用 10X 或 20X 物鏡，三種顏色的圖像:DAPI用于 Hoechst 核染色，F(xiàn)ITC 用于 CalceinAM, TRITC 用于 MitoTracker Orange。具有代表性的復合圖像如圖 3A 所示。圖像分析采用細胞分類或多波長細胞分類分析模塊。分析算法首先定義細胞核，然后根據(jù) Calcein AM 或 MitoTracker 橙色斑點的強度將細胞分為陽性或陰性。陽性細胞數(shù)量、細胞面積或染色強度的減少表明毒性作用。圖 3b 顯示對照和受損細胞的圖像，以及 calcein AM 的分析掩模。不同檢測結果的 EC50 值來自濃度依賴性結果，如表 1 所示。

表型變化的多參數(shù)分析可以檢測毒性，并提供有關毒性機制的信息。值得注意的是大多數(shù)化合物顯示特定心臟毒性，IC50 值濃度抑制跳動率 ? log 或低于減少鈣黃綠素陽性細胞數(shù)量的影響細胞毒性的濃度。與此相反阿霉素的細胞毒性作用與抑制跳動速率的濃度相似。

圖 3 心臟細胞的成像分析。(A) 心肌細胞的圖像 ( 20 x 放大 ) 染色活細胞染料鈣黃綠素，MitotrackerOrange 染料檢測線粒體膜電位，赫斯特核染料 ( 來自 Thermo Fisher Scientific，濃度分別是 0.5 μM，0.2 μM，和 0.5 μM )。 (B) 多參數(shù)分析的圖像和分析掩模。I-Cell 誘導的心肌細胞在 24 小時內(nèi)接受了化合物的處理然后用核染色劑 (Hoechst 33342)，Calcein AM 和 MitoTracker Orange CMTMRos 染色。圖像和分析掩模比較了對照細胞和 0.1 μM staurosporine 及 10 μM 阿霉素處理的細胞。細胞用DAPI、FITC 和 TRITC 用 10 xPlan Fluor 物鏡成像。圖像顯示細胞核 ( 藍色 )，Calcein AM 染色 ( 綠色 )，線粒體 ( 橙色 )。使用細胞分類分析模塊對圖像進行分析，該模塊優(yōu)化了 Calcein AM 陽性細胞或有絲分裂細胞橙色陽性細胞的定量。分析掩膜:淺綠色陽性核，紅色陰性核，綠色肌動蛋白細胞骨架。EC50 值如表 1 所示。

* 活細胞數(shù)量 ( Calcein AM 染色為陽性細胞 )，以及活細胞總面積，和圖像檢測分析得到的 Calcein AM 染色平均熒光強度。** 空白細胞顯示在Z高濃度測試下無效應 (50 μM)
表 1 心臟細胞復合效應的多參數(shù)評價。 抑制鈣振蕩頻率的 EC50 值與細胞毒性讀數(shù) EC50 值進行了比較，此 EC50 值與細胞活力、細胞擴散和鈣調(diào)素 AM 信號強度有關。
結論
結果表明，多種分析方法可用于定量篩選 iPSC 心肌細胞中的化學效應，并實現(xiàn)快速和高性價比的多維生物圖譜分析。