簡介
開發(fā)更復(fù)雜的、生物相關(guān)的和預(yù)測的基于細(xì)胞的化合物篩選方法是藥物發(fā)現(xiàn)中的一個(gè)主要挑戰(zhàn)。三維 (3D) 分析模型的開發(fā)和集成正變得越來越流行，并驅(qū)動(dòng)著生物轉(zhuǎn)化學(xué)的發(fā)展。具體而言，3D 培養(yǎng)物具有精致濃縮了人體組織各方面特征的優(yōu)點(diǎn)，包括結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組織、細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，以及更多生理相關(guān)的特征延伸。水凝膠廣泛用于模擬在 3D 環(huán)境中生長的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)。水凝膠是聚 ( 乙二醇 ) (PEG) 為基礎(chǔ)，完全合成的，全透明的物質(zhì)。水凝膠通過摻入 MMP 切割位點(diǎn)來幫助細(xì)胞遷移，并包含 RGD 細(xì)胞粘連基序以支撐細(xì)胞的粘附作用。完全合成的水凝膠是預(yù)先鋪展在 96 孔板中，其特征在于深層次的密度梯度促進(jìn)細(xì)胞在水凝膠表面上進(jìn)行三維滲透 ( 3D ProSeedTM 水凝膠，ECICA 技術(shù) )。這種水凝膠預(yù)制板使用方法簡便，同時(shí)能很好的兼容自動(dòng)化設(shè)備 ( 圖 1 )。
同時(shí)，人類誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 (iPSC) 衍生的神經(jīng)元也越來越多地用于生理細(xì)胞模型的開發(fā);與用于神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用的原代細(xì)胞和動(dòng)物模型相比，它們的人類起源，更長久的再生能力和無限量的可用性使它們在神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)應(yīng)用中獨(dú)具優(yōu)勢。在多孔板中形成 3D 神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)我們優(yōu)化了 96 孔板的細(xì)胞培養(yǎng)和染色，并發(fā)展了完善的共聚焦成像及分析方法，讓神經(jīng)元以 3D 模型的形式進(jìn)行形態(tài)表型和生存能力的測量。

用于測定的細(xì)胞是 CN.4U TM (AxiogenAG)， 是由神經(jīng)元 ( 谷氨酸能、多巴胺能和GABAergic ) 和星形膠質(zhì)細(xì)胞組成的人 iPSC誘導(dǎo)細(xì)胞混合體。CNS.4UTM 細(xì)胞在 3D ProSeedTM 水凝膠 (Ectica Technologies)中孵育 14 天。細(xì)胞以 40000 個(gè)神經(jīng)元每孔的密度培養(yǎng)在 200 μl 培養(yǎng)基中。對于選定的研究，也評估了細(xì)胞接種密度的影響( 5000 ～ 8000 個(gè)細(xì)胞/孔 )。培養(yǎng)基的組成包括 50:50 混合神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + DMEM/ F12 + 補(bǔ)充劑 (Axiogenesis)。細(xì)胞接種在水凝膠的表面，然后滲透到水凝膠內(nèi)部 ( 圖1 )。神經(jīng)突起生長開始于種植后 24 h，接著連續(xù)培養(yǎng) 14 天以上。通過透射光成像監(jiān)測神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成過程。對于端點(diǎn)測量，使用 4% 甲醛固定細(xì)胞，然后用 0.1% 的 Triton X-100 通透，并用熒光抗體結(jié)合抗體對 TUJ-1 神經(jīng)元標(biāo)記物染色，加上 Hoechst 核染色。

優(yōu)勢
? 開發(fā)用于化合物篩選的 3D 神經(jīng)毒性測定；
? 利用水凝膠和高通量成像進(jìn)行高通量的 3D 神經(jīng)突觸長度測定；
? 進(jìn)行定量測量，可用于定義 IC50值并比較各種化合物的毒性。

通過圖像堆疊生成 3D 立體圖像高含量成像分析可用于評估治療對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成的影響。沿著軸向 ( Z-堆疊 ) 在不同平面處獲得一系列圖像 ( 圖2 )。 使用配有 10x 或 4x 物鏡的 ImageXpress MicroConfocal 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像自動(dòng)拍攝。成像步徑 5 - 10 μm 的 11-33 個(gè)平面的 Z-堆疊，覆蓋深度可達(dá) 150-300 μm。除了自動(dòng)保存 2D 投影 ( 儀器熒光通道支持的Z大投影或Z佳聚焦 ) 圖像外，還保存了所有單個(gè)圖像并用于 3D 分析。

通過一系列 2D/3D 圖像獲取測定值使用集成式 Meta Xpress 軟件中提供的3D 分析模塊進(jìn)行圖像分析。有兩種方法可以進(jìn)行定量分析：投影圖像 (2D) 分析或3D 分析。使用神經(jīng)突觸生長算法分析 2D獲得儀器熒光通道支持的Z大投影圖像( Hoechst 染色和 TuJ-1 熒光 )。 表型讀數(shù)包括通過多重讀數(shù)定量表征神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的長度和復(fù)雜性，包括測量神經(jīng)突向外生長，過程和分支的數(shù)量，以及細(xì)胞數(shù)量和活力。 獲得儀器熒光通道支持的Z佳焦面投影圖像用于分析透射光圖像。投影圖像的分析能夠快速準(zhǔn)確地定量這些表型。圖3 顯示了使用透射光，熒光 ( TuJ-1 和核染色 ) 的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的圖像示例， 以及用于測量神經(jīng)突向外生長的分析建模。

圖 3 2D 投影圖像進(jìn)行分析。 ( 頂圖 ) 神經(jīng)元的透射光投影圖像，以及進(jìn)行分析的建模疊加圖層。CNS.4UTM 細(xì)胞以不同的接種密度 ( 5,000-80,000 個(gè)細(xì)胞/凝膠 ) 接種在 3D ProSeedTM 上。將細(xì)胞培養(yǎng)14 天，然后在 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)上進(jìn)行染色成像。進(jìn)行 3D 成像 ( Z-堆疊 ) 并使用 2D 投影圖像進(jìn)行分析：獲得儀器熒光通道支持的Z大投影圖像和Z佳焦面圖像。分析自動(dòng)測量的細(xì)胞數(shù)，神經(jīng)突向外生長 ( 神經(jīng)突觸的長度 )，以及過程和分支的數(shù)量。圖表顯示了各種測量值對神經(jīng)元數(shù)量的的依賴性。顯示三個(gè)孔板的平均值。MetaXpress 3D 分析模塊將不同平面的對象組合在一起，以創(chuàng)建細(xì)胞和網(wǎng)絡(luò)的三維可視化。3D 可視化圖層代表了單個(gè)細(xì)胞核 ( 假彩色 ) 和 TuJ-1 陽性神經(jīng)突和細(xì)胞體 ( 綠色 ) ( 圖 4 )。 MetaXpress 自定義模塊編輯器可以自定義向外生長的神經(jīng)突觸和細(xì)胞核。首先在每個(gè)平面中找到對象， 然后使用“通過Z佳匹配連接”功能在 3D 空間中連接。3D 分析在整個(gè)基質(zhì)體積內(nèi)提供更精確的細(xì)胞定量，包括有重疊的物體。

3D 水凝膠可用于化合物篩選
表型讀數(shù)包括通過多路讀數(shù)定量表征神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的范圍和復(fù)雜性。我們評估了測定重現(xiàn)性，表征了多次測量，并測試了一系列已知神經(jīng)毒劑的化合物。比較了兩種分析方法：使用標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)突生長算法分析投影圖像，使用定義神經(jīng)突，分支和核的定制模塊進(jìn)行 3D 分析。我們通過在接種后 72 小時(shí)用化合物處理以這種形式生長的細(xì)胞來評估水凝膠中神經(jīng)毒性研究的可行性，測量處理后 7-10 天的效果。( 圖 5 )。每 2 天更換含有化合物的培養(yǎng)基。處理后，將這些培養(yǎng)物固定，染色，并如上述方法進(jìn)行成像。然后，我們測量了所選化合物對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) ( 神經(jīng)突向外生長和其他讀數(shù) ) 的濃度 - 反應(yīng)效應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)提供了使用測定系統(tǒng)進(jìn)行神經(jīng)毒性評估的概念證據(jù)。

圖 4：MetaXress 軟件對水凝膠中細(xì)胞和網(wǎng)絡(luò)的三維評價(jià)。 ( 左上 ) 3D 可視化顯示細(xì)胞核 ( 偽色 ) 和
TUJ-1 陽性突起和細(xì)胞體 ( 綠色 )。( 右上 ) 單個(gè)平面中定義出來的神經(jīng)生長的建模圖層。進(jìn)行 3D 分析，
確定每個(gè)孔的神經(jīng)突起的數(shù)量、神經(jīng)突的總體積、分支點(diǎn)的數(shù)目和細(xì)胞 ( 細(xì)胞核 ) 的數(shù)目。圖表說明了
測量數(shù)據(jù)對神經(jīng)元數(shù)量的依賴性 ( 三聯(lián) )。

總結(jié)
我們開發(fā)了一種定量高通量檢測方法，可以評估 3D 神經(jīng)元培養(yǎng)物的活力和形態(tài)變化。使用 3D ProSeedTM 水凝膠，CNS.4UTM人源 iPSC 衍生的神經(jīng)細(xì)胞和共聚焦高內(nèi)涵成像，該方法可用于高通量化合物毒性篩選和安全性評估。高分辨率成像和多參數(shù)分析可進(jìn)行神經(jīng)突和單細(xì)胞計(jì)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)表征神經(jīng)突發(fā)育和 3D 分支。使用 2D 和3D 分析提供定量測量，可用于計(jì)算 IC50 值和比較各種化合物的毒性。