一、樣品提取 

樣品稱取脫脂： 稱取均質(zhì)后的待測樣品 2.00 g( 精確到 0.01 g)，置于 50  mL 離心管中加入 10 mL 甲醇 / 水混合物 (2:1, v/v)，振 蕩混勻 10 min，4000 r/min 離心 10 min，吸取清液棄掉， 離心管中試樣備用。 

水解衍生化： 向上述離心管中加入 20 mL 0.2 mol/L 鹽酸，振蕩混勻 10  min，后加入 0.4 mL 0.05 mol/L 2- 硝基苯甲醛 (0.075 g 2- 硝基苯甲醛溶于 10 mL 二甲亞砜 )，渦旋混勻 1 min，置于 37℃恒溫振蕩器水浴中避光反應(yīng) 16 h。將上述衍生液，放置 至室溫，加入 5 mL 0.1 mol/L 磷酸氫二鉀溶液，用 1 mol/L  NaOH 調(diào)節(jié) pH 到約 7.4，4000 r/min 離心 10 min，上清液 ( 對 脂肪含量多的試樣，可加入 5 mL 正己烷，振蕩 2 min，4000  r/min 離心 5 min 吸取并棄掉正己烷 ) 待凈化。 

二、SPE 柱凈化（Copure? HLB，60 mg/3 mL） 

活化：依次用 5 mL 甲醇、10 mL 水活化。 

上樣和洗脫：取上述備用液控制流速小于 2 mL/min 過柱。待 樣液全部通過后用 10 mL 水淋洗上樣柱，棄去全部流出液并真 空抽干，Z后用 5 mL 乙酸乙酯洗脫柱子上的待測成分。 

重新溶解：收集洗脫液，于 40℃氮氣吹干，準(zhǔn)確加入 1 mL 乙腈 / 水溶液 (1:2, v/v) 溶液溶解殘余物混勻，0.22 μm 濾 膜過濾，供高效液相色譜測定。

三、儀器條件 

設(shè)備：Waters Alliance 2695 色譜柱：XB-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) 檢測器：Waters 2487 紫外檢測器 檢測波長：275 nm 流動相：A：乙腈   B：0.01 mol/L乙酸銨（0.77 g乙酸銨用水定容至 1 L， 甲酸調(diào) pH=3.5） 洗脫方式：梯度洗脫，見表 1 

表 1 流動相梯度洗脫程序