簡介
為了生存，細胞需要 ATP 形式來提供能量維持正常生理活性。這種形式的能量是通過糖酵解和線粒體呼吸過程產(chǎn)生的。當兩者都產(chǎn)生 ATP 時，糖酵解在缺乏氧氣的情況下可以發(fā)揮作用，而線粒體在氧化磷酸化 (OXPHOS) 的Z后一步需要氧氣參與產(chǎn)生 ATP。這些途徑在適應環(huán)境壓力、底物可用性和缺氧的同時，動態(tài)地轉(zhuǎn)變以滿足細胞的能量需求。一般而言，測量其動態(tài)的變化提供了比單點測量 ( 例如 ATP 終點法 ) 更多的關于代謝反應的信息。呼吸作用受到抑制是藥物毒性后線粒體功能紊亂的重要、敏感指標。線粒體功能的異常與越來越多的疾病有關，從神經(jīng)退行性病變到癌癥。了解這些途徑是如何應對效應化合物作出何種反應，可以為了解細胞的整體功能和決定細胞命運的潛在機制提供有用的見解。
新型檢測試劑盒的出現(xiàn)和更多功能微孔板讀板機的問世，為實現(xiàn)基于微孔板形式的代謝分析提供了有效的手段。這里，我們描述了在 SpectraMax i3x 微孔讀板機上使用 Agilent MitoXpress Xtra 耗氧量分析和 Agilent pH-Xtra? 糖酵解分析。采用基于細胞檢測的葡萄糖氧化酶 (GOx)法，使用標準 96 孔板評價細胞氧耗和糖酵解。

優(yōu)勢
? 實時監(jiān)測細胞和微生物耗氧量和其胞外酸化率
? 高靈敏 TRF 檢測手段，可實現(xiàn)簡單、混合即檢測的兩步法工作流程
? 預設 SoftMax Pro 模板實現(xiàn)快速數(shù)據(jù)獲取和分析

MitoXpress Xtra 耗氧量分析可以直接實時測量細胞耗氧量。該試劑是一種氧敏感的水溶性、穿膜形熒光探針。通過 O2 淬滅熒光信號，使得信號與孔中 O2 的濃度成反比。隨著氧氣的消耗，熒光逐漸增加，因此利用動力學測量，用戶可以通過監(jiān)測信號增加的速度來推斷線粒體的活性。
The pH-Xtra 糖酵解檢測試劑可實時的、動態(tài)的檢測細胞外的酸化率。糖酵解途徑的葡萄糖它可以產(chǎn)生丙酮酸鹽，用于在Krebs 循環(huán)中進一步氧化或產(chǎn)生乳酸鹽 ( 乳酸 )，這使得細胞酸化胞外環(huán)境。pH 值的變化可使用 pH-Xtra 進行檢測，為解糖酵解活性的研究提供了依據(jù)。如同 MitoXpressXtra 一樣，pH-Xtra 在生物范圍內(nèi)表現(xiàn)出靈敏的信號反應，可靈活、高通量地評估細胞外酸化率，并且在反應過程中不被消耗。根據(jù)熒光信號隨時間的變化計算細胞外酸化率。使用 MitoXpress Xtra 或 pH-Xtra 試劑的為了獲得更高的檢測靈敏度，建議在微孔板讀板機上使用時間分辨熒光檢測功能。SpectraMax i3x 微孔板讀板機標配光吸收、熒光和發(fā)光檢測模式。MitoXpress Xtra 和 pH-Xtra 試劑所需的時間分辨熒光檢測可通過添加時間分辨 (TRF) 檢測卡盒實現(xiàn)。TRF 檢測卡盒內(nèi)置專用光源和發(fā)射光濾光片，能夠?qū)崿F(xiàn)更高靈敏度的性能。獲取和分析氧氣消耗和糖酵解活力過程都可通過使用 Sofmax pro.org 官 網(wǎng) 為SoftMax Pro 軟件 7.0.3 或更高版本提供的預設模板實現(xiàn)。

材料
? HepG2 細胞 (ATCC cat. #HB-8065)
? 來自黑曲霉-IV 型的葡糖氧化酶(Sigma-Aldrich cat. #G2133)
? 完全生長培養(yǎng)基
? Dulbecco 的改良 Eagle培養(yǎng)基-高葡糖 (DMEM,Sigma-Aldrich cat. #D5796)
? 胎牛血清(Sigma-Aldrich cat. #F2442)
? 青霉素/鏈霉素(Sigma-Aldrich cat. #P4333)
? 測試化合物
? 抗霉素 A(Sigma-Aldrich cat. #A8674)
? 乙腈4- ( 三氟甲氧基 ) 苯基氫化區(qū)(FCCP, Sigma-Aldrich cat.#C2920)
? 2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG, Sigma-Aldrich cat.#D8375)
? 寡霉素 A(Sigma-Aldrich cat. #75351)
? MitoXpress Xtra 耗氧量分析試劑(Agilent Technologies cat.#MX-200-4), 包含:
? MitoXpress Xtra 試劑
? 封閉油
? pH-Xtra 糖酵解分析試劑(Agilent Technologies cat.#PH-200-4), 包含:
? pH-Xtra 試劑
? 呼吸緩沖片
? 微孔板
? 96-孔, 底透, 組織培養(yǎng)微孔板(Sarstedt cat. #83.3924.300)
? SpectraMax i3x 多功能微孔讀板機(Molecular Devices, cat. #i3x)帶 TRF 檢測卡盒 (Molecular Devices cat. #0200-7008)

方法
對照信號
為了評估信號與空白比 (S:B) 和信號倍數(shù)增加 (F0:F)，建立了 96 孔板無細胞動力學實驗。針對 MitoXpress Xtra 耗氧量分析建立了如下對照孔：
? Blank (B) = 培養(yǎng)基
? Signal control (S, F) = 培養(yǎng)基和MitoXpress Xtra 試劑
? GOx control (F0) = 培養(yǎng)基和利用 0.1 mg/mL GOx 脫氧的試劑針對 pH-Xtra 糖酵解分析準備了如下對照：
? Blank (B) = 呼吸緩沖液
? Signal control (S, F) = 呼吸緩沖液和pH-Xtra 試劑
? GOx control (F0) = 包含pHXtra試劑和0.1 mg/mL GOx的呼吸緩沖液基于細胞的檢測HepG2 細胞以每孔 50,000 個接種于 96-孔、底透的組織培養(yǎng)微孔板中。細胞培養(yǎng)孔外周圍的孔不用于細胞培養(yǎng)，但需加入PBS 以避免邊緣效應。為了確保細胞的均勻分布，細胞先在室溫下孵育 15 分鐘，然后在孵箱中過夜培養(yǎng) ( 95% 濕度下 5%CO2, 37°C )。對于 MitoXpress Xtra 耗氧量分析實驗，MitoXpress Xtra試劑溶于 1 mL 去離子水中，然后在 37°C 下進行如孵育。利用細
胞用完全生長培養(yǎng)基小心清洗細胞，以免將細胞從孔底沖走。在每孔中加入 80 μL預熱的完全生長培養(yǎng)基，然后將孔板放置在孔板加熱器上，使其平衡到 37℃。使用自動移液器將 10 μL MitoXpress Xtra 試劑加入除空白孔的所有孔中，而空白孔則代之以加入 10 μL 水。

10 μL 的 10X 化合物 ( FCCP、寡霉素、抗霉素 A ) 或 0.1% 終濃度的 DMSO 水溶液以3 個復孔進行加液。每孔頂部加入 100 μL封閉油以限制氧氣進入樣品。接下來將孔板移入 SpectraMax i3x 讀板機中，利用SoftMax Pro 軟件 7.0.3 或更高版本中的預置模板進行數(shù)據(jù)采集。對于 pH-Xtra 糖酵解分析實驗，細胞檢測前首先在 37°C、95% 濕度和無 CO2 條件下孵育 2.5 小時。與此同時，pH-Xtra 試劑重溶于 1 mL 去離子水中，再孵育至37°C。用 50 mL 去離子水溶解呼吸緩沖片制成呼吸緩沖液，然后調(diào)節(jié) pH 至 7.4，將溶液過濾滅菌。微孔板中的細胞用呼吸緩沖液小心清洗。每孔加入 80 μL 預熱的呼吸緩沖液，然后將孔板放置在孔板加熱器上，使其平衡到 37℃。使用自動移液器將10 μL pH-Xtra 試劑加入每孔中。10 μL 的10X 化合物 ( 2-脫氧葡萄糖、寡霉素 ) 或0.1% 終濃度的 DMSO 水溶液以 3 個復孔進行加液。
數(shù)據(jù)采集和分析
利用 SpectraMax i3x 讀板機上 TRF 檢測卡盒獲取實驗數(shù)據(jù)。在 TRF 模式下，針對MitoXpress Xtra 和 pH-Xtra 試劑的優(yōu)化檢測參數(shù)如表 1 所示。每次讀數(shù)為 100 次信號收集被認為是針對這一實驗的Z佳選擇( 數(shù)據(jù)未展示 )。檢測前至少 15 分鐘將讀板機溫度設置到 37°C。將微孔板放入讀板機，利用 SoftMax Pro 軟件將動力學數(shù)據(jù)跟蹤記錄為一段時間內(nèi)的強度。動力學讀數(shù)設置為 2 到 4 分鐘間隔，總時間 45 到200 分鐘。對于每個實驗，選擇Z短的間隔。

在將數(shù)據(jù)導出到 Excel 之前，在軟件中對數(shù)據(jù)進行了修正。利用 Excel 中的斜率函數(shù)計算氧耗率 (MitoXpress Xtra) 或糖酵解活性 (pH-Xtra)。在圖的線性部分確定斜率，以確保查詢樣本信號曲線的適當部分。兼容 Molecular Devices 微孔板讀板機的SoftMax Pro 7.0.3 或更高版本軟件預置檢測模板，其可從 www.softmaxpro.org 官網(wǎng)下載。推薦的讀板機檢測參數(shù)設置列在板的儀器設置部分。若要在軟件中直接處理數(shù)據(jù)，請使用動力學運算模式來計算速率。動力學數(shù)據(jù)的線性部分可以通過在運算對話框中手動選擇延遲和結(jié)束時間來進行調(diào)整。
結(jié)果
MitoXpress Xtra 耗氧量分析實驗為評估Z佳儀器設置，使用無細胞動力學實驗計算信噪比 (S:B) 和信號倍數(shù)增加(F0:F)。
SpectraMax i3x 讀板機獲得了超過 10 倍的 S:B 值，如圖 1 所示。為了確定信號的倍數(shù)增加，我們檢測了一個用 GOx 進行脫氧的 GOx 對照 (F0)。與加氧信號對照 (F)相比，GOx 對照的信號大約增加了 3 倍，表明該檢測方法的建立是正確的，并且正在檢測氧耗量。細胞實驗用于評估 SpectraMaxSpectraMax i3x 讀板機與 MitoXpress 實驗的兼容性 ( 圖 2 )。用兩種影響細胞耗氧量的化合物寡霉素和 FCCP 來處理細胞。未經(jīng)處理的細胞顯示，隨著培養(yǎng)基中氧的耗盡， MitoXpress Xtra 信號增加。寡霉素通過抑制 ATP 合成酶降低耗氧量，導致耗氧量低于未處理的細胞 ( 圖 2，寡霉素 )。 FCCP 通過解偶聯(lián) ATP 合成酶的呼吸復合物 ( 圖 2，F(xiàn)CCP ) 來增加氧氣消耗，因此 FCCP 處理的細胞的耗氧率顯著
高于未處理的細胞。

pH-Xtra 糖酵解分析實驗與 MitoXpress Xtra 實驗一樣，測定pH-Xtra 糖酵解實驗的信噪比，以確保Z佳讀數(shù)設置。對照孔的信噪比高于 100 ( 圖3 )。信號對照代表呼吸緩沖液的起始 pH值。與 MitoXpress Xtra 一樣，使用 GOx對照來確定信號倍數(shù)增加。這一對照通過酸化緩沖液與葡萄糖反應產(chǎn)生 H+ 離子 ( 圖3 )。信號倍數(shù)比呈顯著增加 ( 例如，比值
>3 )，表明該檢測方法正確建立，并在測定酸化過程中起著重要作用。pH-Xtra 糖酵解實驗評估細胞外酸化的能力如圖 4 所示。用兩種化合物，寡霉素和2-DG 處理細胞，調(diào)節(jié)細胞外酸化。寡霉素處理通過抑制線粒體 ATP 的產(chǎn)生而增加
pH-Xtra 信號( 圖 4，寡霉素 )，通過增加糖酵解 ATP 的產(chǎn)生而導致細胞對 ATP 的損失。2-DG 治療通過競爭性抑制葡萄糖磷酸化降低了信號變化的速率，從而通過糖酵解降低了乳酸鹽的產(chǎn)生 ( 圖 4, 2-DG )。
結(jié)論
SpectraMax i3x 微孔板讀板機其性能高于Agilent 技術所規(guī)定的信號性能標準，并成功地用于基于細胞分析線粒體功能和糖酵解流的測試。預設的用于 Molecular Devices讀板機的 SoftMax Pro 軟件模板可用于MitoXpress Xtra 和 pH-Xtra 測試信號表現(xiàn)以及獲取和分析數(shù)據(jù)。可以在 Excel 中或直接從 SoftMax Pro 軟件中的信號中獲得其速率值，并且可以進一步利用數(shù)據(jù)在軟件中進行繪圖，或直接導出至其它軟件進行曲線擬合和圖表制作。