介紹
Transcreener HTS 是一種通用的，高通量的生化測定平臺，該測定法是基于核苷酸 (ADP) 的檢測，核苷酸可由數(shù)千種激酶催化形成，其中很多激酶的催化共價調(diào)節(jié)反應(yīng)對細(xì)胞的信號傳導(dǎo)至關(guān)重要，并作為靶標(biāo)在藥物發(fā)現(xiàn)中具有重要價值。

TranscreenerTR-FRET 測定法是一步競爭 性免疫測定法，可直接檢測帶有遠(yuǎn)紅熒光標(biāo)記的核苷酸的熒光信號。該測定
法是基于時間分辨熒光的共振能量轉(zhuǎn)移 (TR-FRET) 的原理。該測定體系中使用的是與高特異性單克隆抗體 - 淬滅劑偶合
物結(jié)合的遠(yuǎn)紅示蹤劑，在紫外范圍 ( 約 330 nm ) 激發(fā)鋱 (Tb)配合物會導(dǎo)致其能量轉(zhuǎn)移到示 蹤劑，并在更高的波長 (665
nm) 產(chǎn)生發(fā)射光。目標(biāo)酶產(chǎn)生的二磷酸或單磷酸核苷酸置換了與抗體鏈接的示蹤劑，導(dǎo)致 TR-FRET 降低 ( 圖 1)。使用
紅色示蹤劑可Z大程度地減少熒光化合物和光散射的干擾。Transcreener TR-FRET 測定法是專為 HTS 設(shè)計的，采用一
步添加，混合和讀取的測定模式。

優(yōu)勢
? 一步添加，混合即讀取的測定形式，非常適用于高通量篩選
? 使用遠(yuǎn)紅示蹤劑和時間分辨熒光技術(shù)，將熒光化合物的干擾降至Z小
? 使用 10 μM ATP 在 10% 的轉(zhuǎn)化率下達(dá)到出色的數(shù)據(jù)質(zhì)量 Z′＞ 0.7

驗證要求
實現(xiàn) Transcreener HTS 分析優(yōu)勢的一個關(guān)鍵因素是獲取數(shù)據(jù)的酶標(biāo)儀的正確設(shè)置，是否正確選擇儀器設(shè)置 ( 包括濾光片和其他組件 ) 可能會影響儀器對任何給定測定的靈敏度。通過運行 10 μM ATP/ADP 標(biāo)準(zhǔn)曲線 (24 次重復(fù) ) 來確定
Transcreener HTS 檢測性能的關(guān)鍵儀器參數(shù)，并使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線模擬酶促反應(yīng)。從 10μM 濃度的 ATP 開始， ADP 的量慢慢增加，ATP 的量則按比例的減少，使腺嘌呤核苷酸總濃度保持在 10 μM。調(diào)整閃光次數(shù)來實現(xiàn) Z′ ＞ 0.5 的質(zhì)量要求。如果 ATP 在 10% 的轉(zhuǎn)化率下能達(dá)到 Z′ 值＞ 0.7，則表明該儀器能夠用于 Transcreener TR-FRET 檢測。

材料
? Transcreener ADP2 TR-FRET Red Assay (cat. #3011-1K)
? ATP/ADP 組合液 : 10 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 0.01%Brij-35 and ATP/ADP ( 結(jié)合成恒定的腺嘌呤濃度 10 μM )
? ADP 檢測混合液 : 1X Stop and Detect Buffer C, 8 nM ADP2Antibody-Tb Conjugate, 26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer
? High FRET 混合液 : 8 nM ADP2 Antibody-Tb Conjugate,26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer, 1X Stop and Detect BufferC, 10 μM ATP
? Low FRET 混合液 : 8 nM ADP2 Antibody-Tb Conjugate,26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer, 1X Stop and Detect BufferC, 10 μM ADP
標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
1. 在 384 孔 板的整 行中分配 10 μL 的每種 ATP/ADP 組合濃度的組合液。
2. 在這些行中加入 10 μL ADP 檢測混合液。
3. 將 10 μL 的 10 μM ATP/0 μM ADP 組合液分配到 P 行。

4. 將 10 μL 的 High FRET 混合液分配到 P1-P12 孔中。
5. 將 10 μL 的 Low FRET 混合液分配到孔 P13-P24 中。
有關(guān)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的詳細(xì)步驟，請參閱相應(yīng)的 Transcreener技術(shù)手冊 (https://www.bellbrooklabs.com/technicalresources/technical-manuals/)。
微孔板讀板機
? SpectraMaxiD5 多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices cat, #ID5-STD)，配備以下組件：
? TRF 增強模塊 (Molecular Devices cat.#0200-7030)
? 濾光片 320/100 ( 可由 Molecular Devices 提供 )
? 濾光片 616/10 (Molecular Devices cat. #6590-0118)
? 濾光片 665/10 (Molecular Devices cat. #6590-012)
? SpectraMax i3x 多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices cat, #I3x)，配備以下組件：
? HTRF 檢測卡盒 (Molecular Devices cat. #0200-7011)

儀器設(shè)置
SpectraMax iD5 和 SpectraMax i3x 讀板機結(jié)合 SoftMax Pro數(shù)據(jù)采集和分析軟件， 使用優(yōu)化的設(shè)置繼續(xù)執(zhí)行以下步驟：
1. 打 開 SoftMax Pro 軟件，“ 讀數(shù)模式“ 選擇 TR-FRET，”讀數(shù)類型“ 選擇 Endpoint； 在 SpectraMax i3x 讀板 機上，光學(xué)配置選擇 HTRF ( 卡盒 )。
2. 在 SpectraMax iD5 讀板機上，安裝 320/100 激發(fā)濾光片以及 616/10 和 665/10 發(fā)射濾光片，然后從激發(fā)和發(fā)射下
拉波長菜單中選擇這些濾光片。在 SpectraMax i3x 讀板機上，安裝 HTRF 卡盒，當(dāng)選擇 HTRF 作為光學(xué)配置時，波長
將自動選擇。

3. 根據(jù)要檢測的微孔板選擇微孔板的“ 類型 ”，待測的微孔板區(qū)域選擇“ 讀數(shù)區(qū)域 ”。
4. PMT 和選項設(shè)置：將每次讀取閃爍 ( 或每次讀取脈沖 ) 設(shè)置為 20 到 100 ( 本文應(yīng)用程序中設(shè)置為 50 )，測量延遲設(shè)
置為 0.05 ms，積分時間設(shè)置為 0.7 ms。
5. 針對每批新的微孔板或所使用的測定體積，zui好優(yōu)化微孔板位置和讀板的高度。只要體積，微孔板批次，示蹤劑和濃度保持不變，相同的儀器設(shè)置可用于后續(xù)板的讀取。 表 1 總結(jié)了上述設(shè)置。

結(jié)論
在本文中，我們驗證了使用 SpectraMax i3x 和 iD5 多功能讀板機進(jìn)行 Transcreener ADP2 TR-FRET 測定過程中表現(xiàn)出的優(yōu)越性能，通過使用優(yōu)化設(shè)置，可以達(dá)到 Z′ 值 > 0.8 ( 表 2 )。對于這兩種儀器，在 2％ 或更高的 ATP 轉(zhuǎn)化率下都達(dá)到了高于驗證標(biāo)準(zhǔn) 0.7的 Z′ 值 ( 圖 2 )，超過了在 10％ ATP 轉(zhuǎn)化下 Z′ 大于 0.7 的Z低驗證要求。