介紹
在葡萄酒生產過程中，檢測蘋果酸、殘留糖、揮發(fā)酸和氨的水平是質量控制非常重要的指標。酶檢測采用微孔板進行，可定量并提高通量，從而節(jié)省時間和人力。殘留糖測定涉及到分析物的酶轉化并產生副產物 NADPH。測定 NADPH的 量，通過340 nm下光吸收檢測，可以直接定量葡萄酒中待測物。下面我們介紹如何使用Molecular Devices 的 SpectraMax Plus384 微孔板讀板機和 SoftMax Pro 軟件高效收集和分析酶檢測葡萄酒中殘留糖的方法。SpectraMax Plus 384 微孔板讀板機優(yōu)勢：
? 波長范圍：190-1000 nm，1 nm 步進，無需加購濾光片，波長涵蓋 UV
? 讀板速度：96 孔板：5 s；384 孔板，16 s
? 溫控：室溫 +4 ℃ ~ 45 ℃
? 比色皿功能：可用標準比色皿，12 × 75mm 比色皿
? OD檢測范圍：0-4 OD

葡萄酒中殘留糖 (RS) 的酶檢測酶反應：
優(yōu)勢
? 與傳統(tǒng)的比色皿方法相比，提高了通量
? 使用 SoftMax Pro 軟件進行自動數(shù)據(jù)分析
? PathCheck 傳感器用于微孔板孔中的吸光度讀數(shù)的標準化
HK：己糖激酶
PGI：磷酸葡萄糖異構酶
G6P-DH：6-磷酸葡萄糖脫氫酶
反應動力學
本實驗主要檢測葡萄酒中兩種主要的糖，葡萄糖和果糖。自從 NADPH 能夠用與其相關的 6-磷酸葡萄糖計量，我們就可以通過檢測 340 nm 下葡萄糖 + 果糖的量來代表 NADPH。
PathCheck 功能
PathCheck 是 Molecualr Devices 公司特有技術，用來檢測微孔板中樣品的光程。該創(chuàng)新方法可將微孔板檢測的光吸收值轉化成 1 cm 標準比色皿的。朗伯-比爾定律
A = E*C*L
E = 吸收率 ( 消光系數(shù) )
C = 濃度

圖 1 SpectraMax Plus 384 光學構造(1)Glucose + ATP (HK) Glucose-6-Phosphate + ADP(2)Fructose + ATP (HK) Fructose-6-Phosphate + ADP(3)Fructose-6-phosphate (PGI)Glucose-6-Phosphate(4)Glucose-6-phosphate + NADP(G6P-DH)Glucose acid-6-phosphate+ NADPH + H+

L = 光程
如果使用比色皿，光程是水平的，因此固定是 1 cm。但是如果使用微孔板，光程是垂直的。所以，光程取決于樣本體積，見圖 2。
SoftMax Pro 軟件
該軟件控制儀器，采集數(shù)據(jù)并提供完整的數(shù)據(jù)分析。特定儀器設置和計算公式能預先保存成客戶自定義的方法。操作員可以直接打開預設方法，讀板后即可得到完整的計算分析結果。
材料
? SpectraMax Plus 384 微孔板讀板機(Molecular Devices cat. #PLUS 384)
? 紫外透 96 孔板 (Corning cat. #3635)
? 移液器( Drummond Scientific cat. #2704174,2705402, 2705412, 2704180; Drummond 數(shù)字微量分液器 cat. #3-000-510 )
? 移液器吸頭(Eppendorf cat. # epT.I.P.S. Reloads022491539, 022491512, 022491547)
? 離心機 (Eppendorf cat. #5424)
? 1.5 mL 離心管(Eppendorf cat. #022364111, 022363557,022363514, 2236357-3)
? D-果糖 (Fisher Scientific cat. #L95-500)
? 己糖激酶/6-磷酸葡萄糖脫氫酶 30 mg(10 mL, Roche cat. #10737275001)
? 磷酸葡萄糖異構酶 10 mg/mL(Roche cat. #10128139001)
? 聚烯吡酮(Fisher Scientific cat. #BP431-100)
? TRIS (Amresco cat. #0497-500G)
? MgSO4?7H2O(Fisher Scientific cat. #M63-500)
? ATP (Boehringer Mannheim cat.#10519987001)
? NADP (Boerhringer Mannheim cat.#10240354001)
? 1.0M HCl(Fisher Scientific cat. #SA431-500)

果糖標準品的制備
混勻試劑，直至完全溶解。標準品存儲在1.5 m 凍存管中，-4 ℃ 保存，做出的標準曲線確定系數(shù) R = 1.000。如果試劑放置太久，可能導致無法做出理想的標準曲線。
RS緩沖液的制備
聚烯吡酮 (PVP) 2.0 g，TRIS 3.0 g 和MgSO4?7H2O 0.5 g 加入至 350 mL 去離子水中，用 1.0 M HCl (≈36 mL) 調節(jié) PH 至7.6。然后，加入 0.15 g ATP 和 0.175 gNADP，容量瓶定容至 500 mL。配置好的緩沖液存儲于 4 ℃。
RS 分析中葡萄酒樣品的制備
如果需要，葡萄酒樣品按照表 2 用去離子水稀釋。渾濁樣品在稀釋前或稀釋后離心或過濾后待用。
樣品用去離子水 1：10 稀釋，相當于標準稀釋 1：10 至 4.0 g / 100 mL。樣品用去離子水 1：100 稀釋，相當于標準稀釋 1：100 至 10.0 g / 100 mL。
方法
第一步：空白對照，標準品和樣品做重復

第二步：從冰箱中取出 D-果糖，室溫融化
第三步：取出分析所需體積的標準品和樣品緩沖液至室溫，燒杯上標記“RS”。這步對獲得理想的確定系數(shù)非常關鍵。
第四步：磷酸葡萄糖異構酶 (PGI) 按照表 3加入緩沖液中。PGI 需要與緩沖液完全混合，但必須輕柔以防酶變性。
第五步：用排槍將 300 μL 緩沖液加入至每孔。
第六步：在相應孔中加入 5 μL 去離子水，標準品或樣品。
第七步：槍頭上下混勻試劑。
第八步：微孔板振蕩混勻 30 s；然后用微孔板讀板機進行初次光吸收讀板

第九步：初次讀板后，立刻用 1-20 μL 排槍往每孔加入 5 μL HK / G6P-DH。
第十步：微孔板振蕩混勻 30 s，室溫孵育21 分鐘。
第十一步：21 分鐘孵育結束后，在微孔板讀板機上采用同樣的參數(shù)設置進行Z終讀板。
儀器參數(shù)設置
儀器通過 SoftMax Pro 軟件控制。參數(shù)設置按照圖 4 在軟件上完成。表 4 顯示的是RS 分析的儀器參數(shù)設置。圖 4 是波長設置和“PathCheck”選項設置的截屏。創(chuàng)建 2 個相同的參數(shù)設置。初始板部分包括除了酶以外的所有試劑。第二塊板部分是加入酶后的實際反應結果。通過 reduction 的設置，用加酶后光密度值減去初始值。
RS分析孔板定義
軟件中的孔板定義是為了在微孔板中標記標準品和樣品的對應孔位置。靈活的孔板定義方式，能夠輕松設置多個樣品和重復。初始板中，無需孔板定義。Z終板中，定義標準品和未知樣品的位置。標準品的濃度通過點擊該孔進行設置，輸入相應濃度。濃度范圍是 0-0.4 g / 100 mL ( 圖5 )。
Reduction設置
Z終板是酶實際反應后的結果。Reduction 設置 ( 圖 6 )，用Z終板的光密度值減去初始板的。因此無需使用板空白。板空白已合并入實驗的質量控制中。

結果
實驗操作見材料和方法中的描述?？装逯邪ǔ敢酝獾乃性噭┳x板的結果作為基線 ( 圖 7，A )。加入酶后混勻，并室溫放置 21 分鐘后讀出Z終讀數(shù) ( 圖 7，B )。SoftMax Pro 軟件自動計算并在相應分組中顯示出標準品的平均值，標準偏差和 %CV ( 圖 8 )。
標準曲線
標準曲線通過“STD”分組的結果繪制出， x 軸是濃度，y 軸是 OD 值的平均值( 圖 9 )。標準偏差作為誤差線，用線性方程擬合。標準曲線用來計算葡萄酒樣品中標記為“Unknown”組樣品的殘留糖濃度。
模板中指定為“未知”的樣本數(shù)據(jù)自動填充為“未知”組部分。每個樣品的殘留糖都是通過軟件中標準曲線的截距計算出來的 ( 圖 10 和 11 )。

結論
SpectraMax Plus 384 微孔板讀板機是通過酶定量分析葡萄酒中殘留糖 (RS) 和蘋果酸 (ML) 的Z佳選擇，同樣也能應用在其他相似分析上，如氨和揮發(fā)酸的檢測。
優(yōu)勢如下：
? 經(jīng)濟且省時
? SpectraMax Plus 384 具有波長靈活和PathCheck 功能，能幫助實驗獲得更精
確和準確的結果
? SoftMax Pro 軟件在分析和計算復雜且數(shù)據(jù)多的結果時非常方便。它能夠預設模板，即開即用的方法，用戶自定義公
式和多樣的圖表選擇
? 其他 Molecular Devices 具有光吸收檢測功能的微孔板讀板機，如：SpectraMaxi3x 多功能微孔板讀板機，也能進行該應用分析
? 針對高通量需求，Molecualr DevicesStakMax 微孔板堆板機系統(tǒng)能夠整合SpectraMax 微孔板讀板機，進行 20、
40 和 50 塊板的自動進樣。