簡(jiǎn)介
由于實(shí)驗(yàn)室的需求經(jīng)常會(huì)隨著研究的需要而變化，因此擁有一臺(tái)多功能微孔板讀板機(jī) ( 具備光吸收、發(fā)光和熒光等多種檢測(cè)模式 ) 已成為必需。擁有一個(gè)易于升級(jí)的讀板機(jī)是非常重要的，例如，提供一個(gè)分配選項(xiàng)以方便進(jìn)行基于細(xì)胞的分析測(cè)定，而不必購(gòu)買多個(gè)專用儀器，可以在確保靈活性的同時(shí)，節(jié)省成本并減少占用工作臺(tái)空間。對(duì)從生物化學(xué)到基于細(xì)胞的檢測(cè)感興趣的研究人員通常希望從每個(gè)微孔板中提取盡可能多的信息，Z常見(jiàn)的例子是 GPCR介導(dǎo)的鈣信號(hào)的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)和離子通道活性檢測(cè)。通常，在這些分析中，信號(hào)會(huì)在幾秒鐘內(nèi)達(dá)到Z大值并衰減，因此必須在化合物注入的同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
在這里，我們展示了使用配備雙注射器系統(tǒng)的 SpectraMax iD3 和 iD5 多功能微孔 板讀 板機(jī)開(kāi)發(fā)信息豐富、基于熒 光的分析方法，以監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化。此外，使用免洗FLIPR 鈣 6 和 6-QF 檢測(cè)試劑盒可以增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)窗口，提高檢測(cè)的穩(wěn)健性，并提供必要的靈活性，適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。

我們利用 SpectraMax iD3 和 iD5 微孔板讀板機(jī)開(kāi)發(fā)了兩種檢測(cè)方法，并與工業(yè)標(biāo)準(zhǔn) FlexStation3 多功能微孔板讀板機(jī)上運(yùn)行的相同檢測(cè)方法進(jìn)行了比較。首先，我們利用 FLIPR 鈣 6試劑盒建立了一種貼壁細(xì)胞的分析方法，以研究 1321N1 人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的毒蕈堿乙酰膽堿受體。然后，我們使用THP-1 細(xì)胞 ( 一種人單核細(xì)胞懸浮細(xì)胞系 )，開(kāi)發(fā)了一個(gè)簡(jiǎn)單的工作流程，以便能夠使 用 FLIPR 鈣 6-QF 檢測(cè)試劑盒分析研究嘌呤能 P2Y 受體。

優(yōu)勢(shì)

? 經(jīng)過(guò)優(yōu)化和驗(yàn)證的試劑可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單，可靠且可重復(fù)的檢測(cè)方案
? 多功能微孔板讀板機(jī)可以滿足您不斷變化的實(shí)驗(yàn)室需求
? SoftMax Pro 軟件支持自定義分析工作流程，以簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)采集和分析流程

材料
試劑
? 1321N1 細(xì)胞 (ECACC cat. #86030402)
? 培養(yǎng)基：DMEM + 2mM 谷氨酰胺 + 10％胎牛血清 (FBS)
? THP 1 細(xì)胞 (ECACC cat. #88081201)
? 培養(yǎng)基：RPMI 1640 + 2mM 谷氨酰胺 +10％胎牛血清 (FBS)
? Hanks’平衡鹽溶液 (HBSS), 含鈣和鎂 (Sigma-Aldrich cat.#55037C)
? 氨基甲酰膽堿氯化物 (Sigma-Aldrich cat. #C4382)
? 乙酰膽堿氯化物 (Sigma-Aldrich cat. #A6625)
? 阿托品 (Sigma-Aldrich cat. #A0132)
? 鹽酸哌侖西平 (Sigma-Aldrich cat. # P7412)
? 腺苷 5'- 三磷酸 (ATP) 二鈉鹽 (Sigma-Aldrich cat. #A2383)
? 尿 苷 5'- 三 磷 酸 (UTP) 二 鈉 鹽 (UTP)disodium salt(Sigmacat. #U6625)
? 丙磺舒 (AAT Bioquest cat. # 20061)
? FLIPR 鈣 6 檢測(cè)試劑盒 (Molecular Devices cat. #R8190)
? FLIPR 6-QF 鈣檢測(cè)試劑盒 (Molecular Devices cat. #R8192)儀器
? SpectraMaxiD3 和 iD5 多 功 能 微 孔 板 讀 板 機(jī) (Molecular Devices)
? SpectraMax 注射器 (Molecular Devices cat. #0200-7029)
? FlexStation 3 多功能微孔板讀板機(jī) (Molecular Devices)
? 8 通道移液器頭配件 (Molecular Devices cat. #0200-6182)

微孔板
? CellBIND 黑色底透無(wú)菌 96 孔微孔板 (Corning cat. #3340)
? Greiner 透明圓底未滅菌 96 孔微孔板 (Greiner cat. #650201)
方法
細(xì)胞制備
將“ 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn) ”的冷凍細(xì)胞 1321N1 迅速解凍，以每孔 2 x 104密度將細(xì)胞接種到加入 200 μL DMEM 培養(yǎng)基的黑色底透 96孔微孔板中。將細(xì)胞在 37℃，95% 濕度和 5% CO2 的條件下孵育過(guò)夜。
在添加 RPMI 的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng) THP-1 細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37℃，95% 濕度和 5% CO2。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將每次測(cè)定所需的細(xì)胞等分到 50 mL 離心管中，并以 1,000 rpm 離心 5 分鐘。
染料負(fù)載
對(duì)于 1321N1 細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，每孔加入 200 μL FLIPR 鈣6 試劑 ( 含丙磺舒 )。 將培養(yǎng)皿在 37℃，5% CO2 條件下孵育 1小時(shí) 45 分鐘，然后在室溫下孵育 15 分鐘。對(duì)于 THP 1 細(xì)胞，離心后將細(xì)胞以 1.25 x 106 細(xì)胞 / mL 的濃度重懸于 FLIPR 鈣 6-QF 試劑 ( 含丙磺舒 ) 中。鈣 6-QF 不使用屏蔽染料技術(shù)，非常適合分析不在孔底部單層，而是真正懸浮的細(xì)胞 ( 圖 1 )。將細(xì)胞在 37℃ 的水浴中振蕩孵育 2 小時(shí)，檢測(cè)前 2 分鐘將 180 μL 的細(xì)胞懸液分配到微孔板每個(gè)孔中。

檢測(cè)方案
使用配備 SpectraMax 注射器卡盒的 SpectraMax iD3 或iD5 讀板機(jī)獲得激動(dòng)劑濃度 - 反應(yīng)曲線，每次獲得一種激動(dòng)劑
濃度。從低濃度到高濃度對(duì)每條濃度 - 反應(yīng)曲線進(jìn)行分析測(cè)定，以減少殘留。用化合物灌注注射器，然后將裝有染料的
細(xì)胞板置于儀器中，每個(gè)濃度使用 3 個(gè)復(fù)孔進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于1321N1 細(xì)胞，使用 SmartInject ? 技術(shù)將 50 μL 5X 濃縮化合物注入每個(gè)孔中，注入過(guò)程中搖勻微孔板以確保試劑混合。設(shè)置參見(jiàn)圖 2。

對(duì)于 THP-1 細(xì)胞，將 180 μL 的 FLIPR 鈣 6-QF 試劑移入微孔板的三個(gè)孔中，然后使用與 1321N1 細(xì)胞的化合物添加類似的方案，但使用較小體積的 20 μL 的 10X 激動(dòng)劑添加，以減少注射偽影。然后將化合物從注射器管路中移除，并用下一個(gè)Z高濃度的化合物灌注注射器。創(chuàng)建一個(gè)新的微孔板設(shè)置，并在下一組三個(gè)復(fù)孔上進(jìn)行檢測(cè) ( 圖 3 )。
對(duì)每個(gè)化合物濃度重復(fù)該過(guò)程。使用 SoftMax Pro 7.1 軟件中的實(shí)驗(yàn)流程編輯器 (Acquisition Plan Editor) 進(jìn)行儀器和注射器的設(shè)置 ( 圖 2 )。對(duì)于拮抗劑研究 ( 僅 1321N1 細(xì)胞 )，移除細(xì)胞培養(yǎng)基，并用每孔 180 μL FLIPR 鈣 6 測(cè)定試劑代替。將細(xì)胞在 37℃ 孵育105 分鐘，加入 20 μL 10X 濃縮拮抗劑，在室溫下平衡 15 分鐘。然后使用注射器 1 或注射器 2 以預(yù)先確定的 EC80 濃度，一式三份地添加體積為 50 μL 的激動(dòng)劑 ( 5X 濃度 )。

圖 2 使用 SpectraMax iD3 和 iD5 讀板機(jī)測(cè)定 1321N1 細(xì)胞中鈣離子的實(shí)驗(yàn)流程設(shè)置。 SoftMax Pro 7.1 ( 及更高版本 ) 軟件中的實(shí)驗(yàn)流程編輯器(Acquisition Plan Editor) 提供一個(gè)圖形化的拖放界面，便于進(jìn)行分析設(shè)置。

圖 3 SoftMax Pro 7.1 軟件中的導(dǎo)航樹(shù)顯示在 SpectraMax iD3 和 iD5 讀板機(jī)上對(duì) 7 點(diǎn)濃度的卡巴醇處理 1321N1 細(xì)胞的濃度 - 反應(yīng)曲線的微孔板設(shè)置。 針對(duì)不同濃度創(chuàng)建不同的微孔板設(shè)置區(qū)域。
在 FlexStation 3 讀板機(jī)上使用類似染料加載和拮抗劑孵育的方案，但是使用了集成的 8 通道移液器將 7 種濃度的激動(dòng)劑和緩沖液對(duì)照同時(shí)從化合物板傳送到細(xì)胞板的每個(gè)孔?；蚴褂?8 個(gè)重復(fù)的 EC80 濃度的激動(dòng)劑用于拮抗劑研究。
結(jié)果
使用配備雙注射器的 SpectraMax iD3 和 iD5 微孔板讀板機(jī)，我們?cè)谫N壁和懸浮細(xì)胞系中均獲得了穩(wěn)健的激動(dòng)劑和拮抗劑濃度 - 反應(yīng)曲線。使用 SpectraMax iD3 和 iD5 讀板機(jī)獲得的貼壁細(xì)胞 1321N1 的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，與在中通量 FlexStation 3讀板機(jī)和 FLIPR?Penta 高通量細(xì)胞篩選系統(tǒng)上獲得的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)一致，在這三個(gè)系統(tǒng)上均達(dá)到類似的Z大響應(yīng) ( 圖 4 )。使用懸浮細(xì)胞 THP-1 時(shí)也得到類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ( 圖 6 )。對(duì)于貼壁細(xì)胞 1321N1，我們使用具有新型屏蔽技術(shù)的 FLIPR鈣 6 試劑來(lái)減少細(xì)胞外的背景。我 們 檢 測(cè)了細(xì)胞對(duì)毒蕈堿受體配體乙酰膽堿、卡巴膽堿、阿托品和哌侖西平的反應(yīng)。
SoftMax Pro 軟件內(nèi)置的 4 參數(shù)曲線擬合和自定義數(shù)據(jù)運(yùn)算可用于計(jì)算激動(dòng)劑 EC50 值以及拮抗劑 IC50 值 ( 圖 5 )。表 1 顯示了使用 SpectraMax iD3 和 iD5 微孔板讀板機(jī)計(jì)算獲得的 EC50 和 IC50 值， 以 及 在 FlexStation 3 讀板機(jī)和
FLIPR Penta 系統(tǒng)上獲得的等效數(shù)據(jù)。使用三種儀器獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間均未觀察到顯著差異。

圖 4 使用 iD5 讀板機(jī) (A)、FlexStation 3 讀板機(jī) (B) 和 FLIPR Penta 系統(tǒng) (C) 檢測(cè) FLIPR 鈣 6 試劑裝載的 1321N1 細(xì)胞對(duì)乙酰膽堿的濃度響應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，之前我們通常使用傳統(tǒng)方法在微孔板底部形成單層載染細(xì)胞，然后輕輕地添加配體來(lái)啟動(dòng)鈣離子反應(yīng)，以避免對(duì)細(xì)胞層產(chǎn)生不利影響。為了節(jié)省分析準(zhǔn)備時(shí)間和細(xì)胞培養(yǎng)耗材，兼顧生成穩(wěn)定可靠的信號(hào)，我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于使用鈣 6-QF 選項(xiàng)的工作流程。這使我們能夠在不受淬滅劑干擾的情況下保持細(xì)胞懸浮狀態(tài)，并且我們調(diào)整了實(shí)驗(yàn)體積以盡量減少干擾，提供一個(gè)良好的信號(hào)窗口 ( 圖 6 )。使用 4 參數(shù)曲線擬合來(lái)計(jì)算激動(dòng)劑的 EC50 值 ( 圖 7 )。
使 用 SpectraMax iD3 和 iD5 微孔板讀板機(jī)計(jì)算出的 UTP和 ATP 的 EC50， 以 及 通 過(guò) FlexStation 3 微孔板讀板機(jī) 和FLIPR Penta 系統(tǒng)獲得的等效數(shù)據(jù)如表 2 所示。使用三種儀器獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間均未觀察到顯著差異。

表 2 從鈣 6-QF 染料負(fù)載的 THP-1 細(xì)胞中獲得的激動(dòng)劑 EC50 值。 所有數(shù)據(jù)均以 μM 為單位，且 n ≥ 3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
總結(jié)
我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將帶有 SmartInject 技術(shù) SpectraMax 注射器卡盒的 SpectraMax iD3 和 iD5 讀板機(jī)，與 FLIPR 鈣 6 和6-QF 檢測(cè)試劑盒共同使用，在貼壁細(xì)胞系和懸浮細(xì)胞系中開(kāi)發(fā)可靠和可重復(fù)的動(dòng)力學(xué)分析檢測(cè)方法是可行的。
對(duì)于使用屏蔽技術(shù)的 FLIPR 鈣 6 試劑負(fù)載的貼壁細(xì)胞 1321N1，使用 SpectraMax iD3 和 iD5 讀板機(jī)得到的激動(dòng)劑和拮抗劑的數(shù)據(jù)與中通量和高通量系統(tǒng) ( 如 FlexStation 3 讀板機(jī)和 FLIPR Penta 系統(tǒng) ) 得到的數(shù)據(jù)是一致的。此外，對(duì)于 THP-1 細(xì)胞，我們S次展示了在 iD3 和 iD5 讀板機(jī)上開(kāi)發(fā)新的工作流程，使得在開(kāi)發(fā)細(xì)胞內(nèi) Ca2+ 分析時(shí)使用懸浮細(xì)胞成為可能。此外，在 SpectraMax iD3 和 iD5 讀板機(jī)上獲得的數(shù)據(jù)與在 FlexStation 3 讀板機(jī)和 FLIPR Penta 系統(tǒng)上獲得的數(shù)據(jù)具有很好的相關(guān)性。這些多功能讀板機(jī)價(jià)格合理且系統(tǒng)可升級(jí)，到手后研究人員可以立即進(jìn)行 ELISA 和細(xì)胞活力測(cè)定。只需添加注射器模塊，即可開(kāi)發(fā)信息豐富、基于細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)分析方法，分析方法可與在高通量系統(tǒng)上開(kāi)發(fā)的方法相媲美。