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細胞培養(yǎng)常見的問題和解決方法

本文由 上海索寶生物科技有限公司 整理匯編

2018-09-02 10:00 1429閱讀次數(shù)

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細胞培養(yǎng)常見問題及回答如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基?培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長??傊?,MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始,各種目的無血清培養(yǎng)**AIMV(12005)培養(yǎng)基(SFM)。L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有Z終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。GlutaMAX-I是什么?培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩(wěn)定?GlutaMAX-I二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I二肽溶液有Z小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養(yǎng)細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養(yǎng)細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞?用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到200~2000個/毫升,在0.1毫升的細胞懸液中加入0.1毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數(shù)分鐘后,用血球計數(shù)板計數(shù)細胞。活細胞排斥臺盼蘭,因而染成藍色的細胞是死細胞。如何消除組織培養(yǎng)的污染?當重要的培養(yǎng)污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。1.在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞,稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。2.分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi),把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0mg/ml。3.每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現(xiàn)空泡,匯合度下降和變圓。4.確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2~3代。5.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。6.重復步驟4。7.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4~6代,確定污染是否以已被消除。培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。目錄上說,Hank's平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么?Hank's平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別?HBS和EBS的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。二價離子YZ胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么?二價離子的確YZ胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持YZ胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。我SYSF900II時,細胞生長良好,但是我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces液和10%胎牛血清時效果好。如果目的蛋白是一個后期蛋白,它將與蛋白酶一起表達,這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中,這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白,從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無血清配方中,蛋白酶作用的**底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題,加入一些蛋白酶YZ劑或加入少量的血清(少于1%),讓血清給蛋白酶提供作用底物。20°C下配制的緩沖液,在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎?對于普通使用的緩沖液,PH值隨溫度變化而變化。下表列出溫度改變10℃時,PH值的變化情況:例如20℃下配制PH7.4Tris緩沖液,40℃時PH值為7.4-(2x0.310)=6.78緩沖系統(tǒng)pKa/20℃[Delta]pKa/10℃Mes6.15-0.110Ada6.60-0.110Pipes6.80-0.08ces6.90-0.200Bes7.15-0.160Mops7.20-0.013Tes7.50-0.200Hepes7.55-0.140Tricine8.15-0.210Tris8.30-0.310Bicine8.35-0.180Glycylglycine8.40-0.280室溫下(25)配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用時PH值是多少?緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mMTris-HC溶液在4℃,25℃,37℃時,不同的PH值。4°C25°C37°C8.17.57.28.27.67.38.37.77.48.47.87.58.57.97.68.68.07.78.78.17.88.88.27.98.98.38.09.08.48.19.18.58.29.28.68.39.38.78.49.48.88.5昆蟲細胞培養(yǎng)的Z適PH值和滲透壓是多少?生長培養(yǎng)基的PH值對細胞的增殖和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會產(chǎn)生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系,在PH值6.0~6.4范圍的大部分應用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細胞系時,培養(yǎng)基的Z適滲透壓是345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養(yǎng)方式,減少技術問題,保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。HighFive細胞有任何其它名稱嗎?HighFive細胞也被稱為Trichoplasiani5B1-4和BTI-TN-5B1-4。PFHM-II和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別PFHM-II(Protein-freeHybridomaMedium)是不包含有蛋白質(zhì)的單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基。如果作為雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基使用,PFHM-II可能需要補充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM既是雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基,也是單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基。它包含低水平的蛋白質(zhì)。在HighFive無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少?HighFive無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度:0.025g/LTween-80,1.0g/LPluronicPoly-all。HighFive細胞用多大的密度凍存?3.0x10E6cells/ml。在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀,加熱后溶解。它是什么?對我的細胞有害嗎?可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解,對實驗不會有不利的影響。如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細胞?能用胰蛋白酶消化嗎?我們QL推薦使用脫落細胞的方法,因為這項技術破壞性Z小,生活力Z高。正如手冊上所顯示,通過使用巴斯德吸液管,讓細胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在必要的情況下,才使用胰酶消化細胞。胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞:1.去除培養(yǎng)基。2.用2ml1xPBS(足以覆蓋細胞表面)洗滌細胞,去除PBS。3.加入2ml1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細胞表面)。4.37℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。5.向細胞中加入2ml細胞培養(yǎng)液,移入錐形管,用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。)6.離心(1100rpm)沉淀細胞。去除培養(yǎng)基。7.用新的培養(yǎng)基重新懸浮細胞。傳代。在Sf9,Sf21,和highFive細胞懸浮培養(yǎng)時,肝素的使用量是多少?為了防止懸浮培養(yǎng)細胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。在重新凍存sf9細胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數(shù)的增加,它的感染能力會降低嗎?通常情況當細胞經(jīng)過30次傳代后,應該返回凍存。無論什么時候計數(shù)時,都應該檢查細胞活力。如果超過95%的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍,細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降,它們的感染力將不在是有效的。Techtips●貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基,可能在放置幾天后顏色變紫。這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時,碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口,在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘,來校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換)?!袢绻毎囵B(yǎng)基偶然被凍,您應該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生,培養(yǎng)基可以正常使用,如果出現(xiàn)沉淀,只能丟棄這些培養(yǎng)基?!衲檎遗囵B(yǎng)基成分表嗎?您可以在GIBCO目錄**章的后面或在我們網(wǎng)站的技術資源部分找到。●當在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時,降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下,抗生素不被滅活,可能對于細胞達到毒性水平?!褚坏┠谛迈r培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時,您應該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。●總之,大部分添加物和試劑Z多可以凍融3次,如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會影響它的性能?!裨谶M行傳代培養(yǎng)時,我們強烈推薦進行臺盼蘭活性記數(shù)。研究者常常通過一個簡單的稀釋(1∶4或1∶2)進行傳代,不進行活性檢測,您可能接種比你認為的低的多的濃度的細胞,這常??赡軐е律L緩慢或培養(yǎng)物根本不生長?!裨谌芙獾囊恢軆?nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解,如果在室溫下放置超過30分鐘,就會變得不穩(wěn)定?!馟IBCO產(chǎn)品的貯存期立足于實時穩(wěn)定性研究結果。產(chǎn)品說明在超過指定的貯存期的一段時間內(nèi),產(chǎn)品仍然在可接受的范圍內(nèi),但是由于在超過指定的效期后,產(chǎn)品的性能和穩(wěn)定性沒有檢測,我們不推薦使用過了效期的產(chǎn)品。

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