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脂肪酸β氧化速率比色法檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

本文由 上??茖W(xué)儀器有限公司 整理匯編

2018-11-18 10:00 1243閱讀次數(shù)

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脂肪酸β氧化速率比色法檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書主要用途脂肪酸β氧化速率(βoxidationrate)比色法檢測(cè)試劑是一種旨在通過棕櫚酰肉堿氧化依賴性鐵氰化物還原,即單位時(shí)間還原產(chǎn)物的峰值降低,即采用比色法來測(cè)定線粒體裂解樣品中脂肪酸β氧化速率的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞、組織中線粒體裂解懸液樣品(動(dòng)物、人體等)脂肪酸β氧化速率的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定。技術(shù)背景脂肪酸β氧化過程(β-oxidation)在動(dòng)物組織的線粒體發(fā)生的脂肪酸代謝通路,可概括為活化、轉(zhuǎn)移、β氧化及Z后經(jīng)三羧酸循環(huán)被徹底氧化生成CO2和H2O,并釋放能量等四個(gè)階段,是體內(nèi),尤其是組織器官,例如肝臟、心臟和骨骼肌等能量內(nèi)平衡的關(guān)鍵代謝通路。食物中甘油三酯提供體內(nèi)三分之一的能量供給,骨骼肌和心臟消耗80%的總能量。脂肪酸代謝異常,將導(dǎo)致脂質(zhì)聚集在非脂肪組織內(nèi),產(chǎn)生慢性病的病理基礎(chǔ),例如糖尿病、心衰、肥胖癥等。其中β氧化,包括脫氫、水合、二次脫氫和硫解,是將活化的各種長度脂酰輔酶酯(acylCoAesters)不斷縮短為乙酰輔酶A(acetylCoA)單位,Z后經(jīng)過三羧酸循環(huán)和呼吸鏈氧化成CO2和水。脂?;o酶A脫氫酶(acylCoAdehydrogenase;AD;EC.1.3.99.3)是脂肪酸代謝進(jìn)入β-氧化后工作的重要酶之一。通過底物棕櫚酰肉堿(palmitoylcarnitine)的氧化產(chǎn)生的電子,由鐵氰化物(ferricyanide)捕獲而還原,其還原速率的檢測(cè),來評(píng)價(jià)β氧化的速率,即吸光值(420nm波長)的下降與時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。產(chǎn)品內(nèi)容緩沖液(ReagentA)20毫升反應(yīng)液(ReagentB)2毫升底物液A(ReagentC)1毫升底物液B(ReagentD)1毫升陰性液(ReagentE)1毫升產(chǎn)品說明書1份保存方式保存反應(yīng)液(ReagentB)、底物液A(ReagentC)和底物液B(ReagentD)在-20℃冰箱里;其余的保存在4℃冰箱里;底物液A(ReagentC)和底物液B(ReagentD)避免光照;有效保證6月用戶自備1.5毫升離心管:用于反應(yīng)操作的容器比色皿:用于比色的容器分光光度儀:用于比色分析實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定準(zhǔn)備準(zhǔn)備好待測(cè)樣品(例如純化線粒體),至于冰槽里備用開啟并設(shè)定好分光光度儀(溫度為25℃):波長420nm和470nm,間隔1分鐘,讀數(shù)6次(共5分鐘),并置零從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化;底物液A(ReagentC)和底物液B(ReagentD)避免光照緩沖液(ReagentA)室溫下均衡溫度背景對(duì)照測(cè)定移取750微升緩沖液(ReagentA)到新的比色皿加入100微升反應(yīng)液(ReagentB)加入50微升底物液A(ReagentC)加入50微升底物液B(ReagentD)上下傾倒數(shù)次,混勻在25℃溫度下孵育3分鐘加入50微升陰性液(ReagentE)上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為背景空對(duì)照【(OD420OD470)0分鐘-(OD420OD470)5分鐘】樣品測(cè)定移取750微升緩沖液(ReagentA)到新的比色皿加入100微升反應(yīng)液(ReagentB)加入50微升底物液A(ReagentC)加入50微升底物液B(ReagentD)上下傾倒數(shù)次,混勻在25℃溫度下孵育3分鐘加入50微升待測(cè)樣品(500微克線粒體蛋白)(注意:樣品須清澈)上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為樣品讀數(shù)【(OD420OD470)0分鐘-(OD420OD470)5分鐘】四、計(jì)算氧化速率[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X1(體系容量;毫升)X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.5(樣品質(zhì)量;毫克)X105(毫摩爾吸光系數(shù))X5(反應(yīng)時(shí)間;分鐘)]=微摩爾鐵氰化物還原/分鐘/毫克注意事項(xiàng)本產(chǎn)品為20次操作,包括背景對(duì)照操作時(shí),須戴手套系統(tǒng)操作過程中,背景測(cè)定只需1次樣品須澄清,至關(guān)重要加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定測(cè)定值由高到低變化;測(cè)定可持續(xù)5分鐘比色測(cè)定后,比色皿須清洗徹底樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有氧化功能建議待測(cè)樣本線粒體蛋白濃度為500微克/50微升(本公司提供Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-30030.1)如果待測(cè)樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度本公司提供系列脂肪酸代謝檢測(cè)試劑產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

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