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細胞彈性蛋白含量比色法(TPPS)定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

本文由 上??茖W(xué)儀器有限公司 整理匯編

2018-11-19 10:00 948閱讀次數(shù)

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細胞彈性蛋白含量比色法(TPPS)定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書主要用途細胞彈性蛋白含量比色法(TPPS)定量檢測試劑是一種旨在通過酸性加熱萃取并轉(zhuǎn)化為可溶性彈性蛋白,與四苯基卟吩四磺酸染料結(jié)合,在堿性條件下,釋放棕紅色染料,酸性處理后,由分光光度儀比色分析,定量檢測細胞樣品中彈性蛋白含量的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。可以用于檢測各種彈性蛋白,包括原彈性蛋白(tropoelastin)、致山黧豆中毒彈性蛋白(lathyrogenic)、α彈性蛋白、k-彈性蛋白等。適用于各種細胞(動物、人體等)或培養(yǎng)上清彈性蛋白水平檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定,檢測準(zhǔn)確。技術(shù)背景彈性蛋白(elastin)是一種不溶性的非極性的堿性蛋白,具有高度抗拉能力(tensilestrength),存在于大動脈、氣管、支氣管、韌帶等結(jié)締組織細胞間。彈性蛋白由多肽二價交聯(lián)隨機扭絞(randomlykinked)組成,通過鎖鏈素(desmosine)和異鎖鏈素(isodesmosine)相連。動物細胞上的原彈性蛋白(tropoelastin)為單體,可溶性,分子量為62至72Kd。與微纖絲(microfibril)糖蛋白結(jié)合,形成彈性基質(zhì)(matrix)或彈性組織筏(raft),構(gòu)成細胞膜表面。通過酸性加熱萃取彈性蛋白,并轉(zhuǎn)化為可溶性衍生物,α彈性蛋白、k-彈性蛋白等,進而使用四苯基卟吩四磺酸(5,10,15,20-tetraphenylporphin-21H,23H-tetra-sulfonate;TPPS)染料與彈性蛋白發(fā)生溫克爾曼反應(yīng)(Winkelmanreaction)結(jié)合,然后在堿性條件下釋放出棕紅色染料,酸性處理后,呈現(xiàn)綠色,通過分光光度儀(445nm波長)測定,分析彈性蛋白的含量。產(chǎn)品內(nèi)容萃取液(ReagentA)毫升沉淀液(ReagentB)毫升清理液(ReagentC)毫升染色液(ReagentD)毫升濃縮液(ReagentE)毫升解離液(ReagentF)毫升強化液(ReagentG)毫升標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentH)毫升稀釋液(ReagentI)毫升產(chǎn)品說明書1份保存方式保存標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentH)在-20℃冰箱里,其余的保存在4℃冰箱里;染色液(ReagentD)避免光照;試劑具有腐蝕性,注意操作安全;有效保證6月用戶自備1.5毫升離心管:用于標(biāo)準(zhǔn)液配制和樣品制備的容器15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器細胞刮脫棒:用于細胞脫離平式搖蕩儀:用于樣品操作干式恒溫儀:用于樣品孵育微型臺式離心機:用于樣品操作200微升1厘米光徑比色皿或96孔板:用于比色分析的容器分光光度儀或酶標(biāo)儀:用于比色分析實驗步驟一、樣品預(yù)處理1)細胞上清處理移取300微升細胞培養(yǎng)上清到1.5毫升離心管加入xx微升萃取液(ReagentA)渦旋振蕩15秒放進100℃干式恒溫儀孵育60分鐘置于室溫下15分鐘冷卻放進微型臺式離心機離心10分鐘,速度為10000g小心移取400微升上清液到新的1.5毫升離心管加入xx微升4℃預(yù)冷的沉淀液(ReagentB)在冰槽里孵育30分鐘,期間每隔10分鐘渦旋振蕩15秒放進微型臺式離心機離心10分鐘,速度為10000g小心抽去上清液,確保無液體殘留;沉淀顆粒透明且肉眼難以看見置于冰槽里備用2)細胞處理準(zhǔn)備好25cm2細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞(1至5X106細胞)小心抽去培養(yǎng)液小心加入xx毫升清理液(ReagentC),覆蓋生長表面小心抽去清理液使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞(注意:可以使用胰酶消化)加入xx毫升清理液(ReagentC),混勻細胞移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始)放進臺式離心機離心5分鐘,速度為300g小心抽去上清液,但保留300微升,混勻細胞顆粒群轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管加入xx微升萃取液(ReagentA)渦旋振蕩15秒放進100℃干式恒溫儀孵育60分鐘置于室溫下15分鐘冷卻放進微型臺式離心機離心10分鐘,速度為10000g小心移取400微升上清液到新的1.5毫升離心管(注意:上清液可能會呈現(xiàn)黃色)加入xx微升4℃預(yù)冷的沉淀液(ReagentB)在冰槽里孵育30分鐘,期間每隔10分鐘渦旋振蕩15秒放進微型臺式離心機離心10分鐘,速度為10000g小心抽去上清液(注意:確保無液體殘留;沉淀顆粒透明且肉眼難以看見)置于冰槽里備用二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管,標(biāo)記為1至4號管分別加入xx微升稀釋液(ReagentI)到1至4號管移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentH)到1號管,混勻小心移取xx微升1號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentH)到2號管,混勻小心移取xx微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentH)到3號管,混勻小心抽去xx微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentH)將1至4號管放進冰槽里備用;標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表管號稀釋液(ReagentI)標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentH)標(biāo)準(zhǔn)彈性蛋白含量1xx微升xx微升xx微克2xx微升xx微升1號管xx微克3xx微升xx微升2號管xx微克4xx微升背景讀數(shù)0分別加入xx微升4℃預(yù)冷的沉淀液(ReagentB)到上述標(biāo)準(zhǔn)管里在冰槽里孵育30分鐘,期間每隔10分鐘渦旋振蕩15秒放進微型臺式離心機離心10分鐘,速度為10000g小心抽去上清液(注意:確保無液體殘留;沉淀顆粒透明且肉眼難以看見)置于冰槽里備用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定分別加入xx微升染色液(ReagentD)到上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液(ReagentH)里(注意:用槍頭抽打使沉淀顆粒溶解)分別加入xx微升濃縮液(ReagentE)渦旋振蕩混勻室溫下,孵育60分鐘,期間每隔15分鐘渦旋振蕩15秒放進微型臺式離心機離心10分鐘,速度為10000g小心抽去上清液(注意:確保沒有液體殘留)加入xx微升解離液(ReagentF)用槍頭抽打使沉淀顆粒溶解,并輔以渦旋震蕩(注意:確保充分溶解)加入xx微升強化液(ReagentG),混勻(注意:呈現(xiàn)綠色)轉(zhuǎn)移到新的200微升1厘米光徑的比色皿或96孔板即刻放進分光光度儀或酶標(biāo)儀檢測(波長445nm):獲得標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光讀數(shù)重復(fù)實驗步驟1至11四次構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:縱座標(biāo)(Y軸)為吸光讀數(shù);橫座標(biāo)(X軸)為標(biāo)準(zhǔn)彈性蛋白含量(微克)(注意:標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光讀數(shù)背景讀數(shù))樣品測定加入xx微升染色液(ReagentD)到上述配制的待測樣品管里(注意:用槍頭抽打使沉淀顆粒溶解)分別加入xx微升濃縮液(ReagentE)渦旋振蕩混勻室溫下,孵育60分鐘,期間每隔15分鐘渦旋振蕩15秒放進微型臺式離心機離心10分鐘,速度為10000g小心抽去上清液(注意:確保沒有液體殘留)加入xx微升解離液(ReagentF)用槍頭抽打使沉淀顆粒溶解,并輔以渦旋震蕩(注意:確保充分溶解)加入xx微升強化液(ReagentG),混勻(注意:呈現(xiàn)綠色)轉(zhuǎn)移到新的200微升1厘米光徑的比色皿或96孔板即刻放進分光光度儀或酶標(biāo)儀檢測(波長445nm):獲得樣品吸光讀數(shù)根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)彈性蛋白含量(微克)(注意:待測樣品吸光讀數(shù)背景讀數(shù))濃度計算注意事項本產(chǎn)品為25次操作,包括標(biāo)準(zhǔn)樣品本產(chǎn)品檢測范圍為5至100微克彈性蛋白操作時,須戴手套系統(tǒng)操作時,標(biāo)準(zhǔn)樣品測定只需1次彈性蛋白沉淀顆粒微小透明,肉眼難以看見操作需要非常細致,包括避免液體殘留、顆粒溶解等,否則會產(chǎn)生誤差試劑具有腐蝕性,嚴(yán)格注意操作安全孵育時,避免光照如果樣品彈性蛋白含量過低,可以濃縮樣品或增加樣品量樣品濃度可以表述為:微克彈性蛋白/細胞量;微克彈性蛋白/細胞總蛋白等通常1X105細胞含有40微克彈性蛋白本公司提供系列彈性蛋白檢測試劑產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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