原理

試料中殘留的氟苯尼考與氟苯尼考胺，用堿化的乙酸乙酯提取，正己烷除脂，固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，內(nèi)標(biāo)法定量。

8.1 提取 稱取試料2g（準(zhǔn)確到±0.02g），于50 mL離心管中，加氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，渦動混勻，靜置15 min。加乙酸乙酯-氨水溶液10 mL，渦動1 min，3000 r/min離心5 min，取上清液于100 mL雞心瓶中，殘渣重復(fù)提取兩次，合并3次提取液。雞心瓶中加5%乙酸2 mL，振搖混勻，于40 ℃水浴中濃縮至1.5 mL。轉(zhuǎn)至另50 mL離心管中，用5% 乙酸2 mL洗滌雞心瓶，洗滌液轉(zhuǎn)至同一離心管，加正己烷5 mL脫脂，渦動1 min，3000 r/min離心5 min棄上層，下層提取液重復(fù)脫脂一次，備用。

關(guān)鍵詞：堿性條件下提取，提取3次

要點：

• 氟苯尼考及氟苯尼考胺，在堿性條件下，更加容易被有機溶劑提取，可以獲得滿意的提取回收率。

• 堿化的乙酸乙酯提取3次，濃縮后正己烷除脂。

關(guān)鍵詞：5%乙酸

要點：

• 在蒸發(fā)前，在雞心瓶中加5%乙酸。有助于保護氟苯尼考胺在操作過程（合并、濃縮）中的回收率。

8.2 凈化 MCX 固相萃取柱依次用甲醇2 mL和水2 mL活化。備用液過柱，用5 %乙酸2 mL淋洗， 用10 %氨甲醇5 mL洗脫。收集洗脫液，于40 ℃氮氣吹干。用30 %乙腈水溶液500 μL溶解殘余物，濾膜過濾，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

關(guān)鍵詞：GB 31658.5-2021與GB/T 22959凈化步驟區(qū)別

要點：

• GB/T 22959之前的氟苯尼考檢測標(biāo)準(zhǔn)，凈化采取的是液液萃取法。

• 對于樣品基質(zhì)比較復(fù)雜的情況，干擾物質(zhì)較多，單純的液液萃取和脫脂凈化，不夠理想的時候，使用SPE小柱將有更好凈化效果，因此新標(biāo)準(zhǔn)GB 31658.5采取了MCX固相萃取凈化。

關(guān)鍵詞: 5 mL氨甲醇洗脫，氮吹

要點：

• Tips：色譜柱或保護柱前加溶劑效應(yīng)消除器（PN：AN80C037，譜寧科技），對于氟苯尼考和氟苯尼考胺檢測限和定量限比較高的藥物，5 mL氨甲醇洗脫后，可不經(jīng)過氮吹，過濾膜后直接進行分析，不但可以滿足檢測要求，而且可以提高效率和目標(biāo)物回收率，同時可以避免出現(xiàn)溶劑效應(yīng)問題。（標(biāo)準(zhǔn)中氮吹的過程，一方面是為了濃縮樣品，另一方面是為了轉(zhuǎn)換溶劑，減少分析中出現(xiàn)的溶劑效應(yīng)問題）。

關(guān)鍵詞：MCX固相萃取柱的特點和使用注意事項

要點：

• 標(biāo)準(zhǔn)中使用的MCX 60 mg/3 mL (PN:AN60A012，納鷗科技），混合型強陽離子交換反相柱，提供了雙重保留模式：強陽離子交換+反相。

• MCX小柱對于堿性化合物具有高的選擇性，能夠選擇性保留陽離子化合物或者堿性化合物。

• 當(dāng)目標(biāo)化合物酸化后，呈現(xiàn)出陽離子特征，通過電荷和分子間力的結(jié)合，從而保留在MCX小柱上，隨后可以通過改變離子強度、PH值破壞分子間作用力，把目標(biāo)分析物洗脫下來。

• 所以前面提到的備用液是5%的乙酸，就是為了凈化步驟上柱創(chuàng)造一個酸性條件。

• 氟苯尼考和氟苯尼考胺在酸性環(huán)境下表現(xiàn)為陽離子，上柱后就能保留在MCX小柱上。隨后是用5%的乙酸淋洗，去除干擾物的同時，需要的分析物仍舊保留在小柱上。

• 洗脫時，洗脫液是10 %氨甲醇，這時目標(biāo)分析物就不在表現(xiàn)為陽離子，從而洗脫下來，實現(xiàn)了凈化效果。