簡介
BRET ( 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移 ) 是一種測量蛋白 - 蛋白或蛋白 - 配體相互作用的技術(shù)，涉及生物發(fā)光供體和熒光受體的相互作用。當(dāng)供體和受體彼此相距小于 10 nm時(shí)，供體激發(fā)受體，然后受體發(fā)射熒光。通過用供體標(biāo)記一種目的蛋白，用受體標(biāo)記該目的蛋白的結(jié)合配體，可以使用酶標(biāo)儀來檢測供體和受體發(fā)射的光，從而測量蛋白質(zhì)相互作用。
Promega 的 NanoBRET? 技術(shù)通過使用更亮的發(fā)光供體 ( NanoLuc 熒光素酶 )、優(yōu)化的能量受體 (HaloTag?-NCT) 以及供體和受體波長之間更寬的分離，改進(jìn)了早期的BRET，包括 BRET1 和 BRET2 ( 見圖一 ) 不足。這些改進(jìn)提供了更強(qiáng)的信號，更好的靈敏度和更低的背景，使得在活細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)相互作用成為可能。檢測 NanoBRET 信號并分析結(jié)果數(shù)據(jù)需要靈敏的儀器和功能強(qiáng)大的分析軟件。標(biāo)配SoftMax Pro 軟件的 SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀可讓研究人員使用優(yōu)化的濾光片組系統(tǒng)獲得 NanoBRET 數(shù)據(jù)結(jié)果，并對結(jié)果進(jìn)行包括曲線擬合在內(nèi)的分析。在這里，我們描述了在 SpectraMax iD5 酶標(biāo)儀上使用 NanoBRET? PPI 質(zhì)控對來驗(yàn)證酶標(biāo)儀功能，該質(zhì)控對由相互作用的蛋白質(zhì)配偶體 p53 和 MDM2 組成。使用 p53 途徑激活劑 nutlin-3 以濃度依賴性方式破壞p53 與 MDM2 的相互作用，并使用 SoftMax
Pro 軟件分析和繪制結(jié)果。
優(yōu)勢
? NanoLuc 帶來更強(qiáng)的光學(xué)信號、更寬的光譜，較其它 BRET 技術(shù)具有更高靈敏度
? 正常生理的活細(xì)胞下能夠更靈敏的檢測蛋白相互作用
? 使用 SoftMax Pro 軟件自動(dòng)計(jì)算 NanoBRET 比率并擬合生成曲線

材料
? NanoBRET PPI 質(zhì)控對(p53, MDM2; Promega cat. #N1641)
? NanoBRET Nano-Glo? 檢測體系(Promega cat. #N1661)
? ViaFect? 轉(zhuǎn)染試劑(Promega cat. #E4981)
? Nutlin-3 (Millipore-Sigma cat. #6287)
? Opti-MEM? 36/5000 減少量的血清培養(yǎng)基 ， 無 酚 紅 ( T h e r m o F i s h e r c a t .#11058021)
? 293 (HEK-293) 細(xì)胞(ATCC cat. #CRL-1573)
? Eagle's Z低限度基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EMEM, Corning cat. #10-010-CV)
? BenchMark? 胎牛血清(Gemini Bio-Products cat. #100-106)
? 青霉素-鏈霉素(10,000 U/mL, ThermoFisher cat.#15140122)
? 6 孔透明微孔板 (VWR cat. #1006-892)
? 96 孔白色平底聚苯乙烯微孔板 (Corningcat. #3917)
? SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices cat. #iD5-STD), 包括以下配置:
? 供體濾光片: 447 nm BW 60 nm (Molecular Devices cat. #6590-0088)
? 受體濾光片: 610 nm LP (MolecularDevices cat. #6590-0117)
方法
將 HEK-293 細(xì)胞以 400,000 個(gè)細(xì)胞/mL 懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)基 ( EMEM + 10％ 胎牛血清 +1％ 青霉素/鏈霉素 ) 中，并接種到 6 孔板上，每孔 2 mL，或每孔 800,000 個(gè)細(xì)胞。使細(xì)胞在 37℃，5％ CO2 下與孔接觸 4-6小時(shí)。然后用 100 μL Opti-MEM 減少量的血清培養(yǎng)基，無酚紅，含 2 μg p53-HaloTag融合載體 DNA 和 0.2 μg NanoLuc-MDM2融合載體 DNA，和 3：1 ViaFect 轉(zhuǎn)染試劑：DNA 比例，來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞在 37℃，5％ CO2 下孵育過夜 20-24 小時(shí)。

通過以 1,000 rpm 旋轉(zhuǎn) 5 分鐘收獲HEK-293 細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基。在 Opti-MEM+ 4％ FBS 中將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至2.2×105個(gè)細(xì)胞/ mL，并分裝在兩個(gè) 15 mL 錐形管。一管用 0.1 μM HaloTag 618 配體處理，另一管無配體處理。將細(xì)胞以每孔2×104 個(gè)細(xì)胞接種到 96 孔白色微孔板中，并立即用 1：3 連續(xù)稀釋的 nutlin-3 ( 每個(gè)濃度 n = 4 個(gè)重復(fù) ) 或 0.5％ DMSO 處理。將細(xì)胞在 37℃，5％ CO2 下孵育過夜。
在 Opti-MEM + 4％ FBS 中制備 5x NanoBRET Nano-Glo 底物溶液，并向每個(gè)孔中加入 25 μL。使用表 1 中所示的設(shè)置在SpectraMax iD5 酶標(biāo)儀上測量供體發(fā)射光(447 nm) 和受體發(fā)射光 (610 nm)。通過將受體信號除以供體信號在 SoftMax Pro軟件中計(jì)算 NanoBRET 比率，并將比率乘以 1000 以獲得整數(shù) milliBRET 單位(mBU)。通過減去不含配體的樣品的平均mBU 來對 mBU 值進(jìn)行背景校正。 分析了n u t l i n - 3 處理的細(xì)胞的結(jié)果 ， 并使用SoftMax Pro 軟件 ( 版本 7.0.3 和更高版本 )中的 4 參數(shù)曲線擬合圖表。在每種濃度的 nutlin-3 下計(jì)算 Z' 因子以評估測定性能。

結(jié)果
使用 SoftMax Pro 軟件中的 4 參數(shù)曲線擬合，繪制 NanoBRET 比率 (mBU) 對nutlin-3 濃度的曲線 ( 圖 2 )。計(jì)算出的
nutlin-3 的 IC50 值為 1.2 μM，與 Promega對 NanoBRET PPI 質(zhì)控對所示的結(jié)果一致。
在用于產(chǎn)生圖 2 所示曲線的所有濃度的nutlin-3 下獲得至少 0.7 μM 的 Z' 因子。對于 0.07 μM 和更低的濃度，Z' 因子等于0.9 μM。 這些值證明了這種 NanoBRET 分析的穩(wěn)定性和低變異性。
總結(jié)
SpectraMax iD5 酶標(biāo)儀配備了用于檢測NanoBRET 供體和受體信號的極佳濾光片，被證明了可以使用 NanoBRET PPI 對質(zhì)控對 (p53，MDM2) 進(jìn)行測定。Nutlin-3用于以濃度依賴性方式破壞 p53-MDM2 相互作用，產(chǎn)生 1.2 μM 的預(yù)期 IC50 值。對于所有測試樣品濃度，計(jì)算以評估測定性能和重復(fù)變異性的 Z' 因子在 0.7 和 1 之間，證實(shí)了 SpectraMax iD5 酶標(biāo)儀的靈敏度和 NanoBRET 實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性質(zhì)。SoftMax Pro 軟件可計(jì)算 NanoBRET 比率并自動(dòng)繪制數(shù)據(jù)，簡化分析。