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精子細胞氧化應(yīng)激活性氧(ROS)魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量試劑盒

本文由 上海銘博生物科技有限公司 整理匯編

2018-11-08 10:00 708閱讀次數(shù)

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主要用途精子細胞氧化應(yīng)激活性氧(ROS)魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在通過自由基探針魯米諾和強化劑的參與下,精子細胞中的活性氧族使發(fā)光物氧化降解并發(fā)光,在化學(xué)發(fā)光儀(Luminometer)的幫助下定量檢測精子細胞活性氧族(過氧化氫)的生成和數(shù)量的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。適用于動物和人體精子細胞的活性氧族的檢測??梢员挥糜诩毎蛲?、衰老、代謝和營養(yǎng)學(xué),以及發(fā)育生物學(xué)(男性不育)等的研究。產(chǎn)品嚴格無菌,即到即用,操作簡易,性能穩(wěn)定,檢測敏感。技術(shù)背景超氧自由基陰離子(superoxideradical;O2-)、過氧化氫(hydrogenperoxide;H2O2)、羥自由基或氫氧基(hydroxylradical;OH-)、過氧化基(peroxylradical;ROO-)、氫過氧自由基(hydroperoxyl;HOO)、烷氧自由基(alcoxylradical)、氮氧基(nitricOxide;NO-)、過氧亞硝基陰離子(peroxynitriteanion;ONOO-)次氯酸(hypochlorousacid;HOCl)、半醌自由基(semiquinoneradical)、單線態(tài)氧氣(singletoxygen)等細胞內(nèi)活性氧族(ReactiveOxygenSpecies;ROS)的產(chǎn)生和增多,甚而導(dǎo)致諸如男性不育、冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。魯米諾(luminol),又稱氨基鄰苯二甲酰肼(luminol;3-aminophthalichydrazide5-amino-2,3-dihvdro-1,4-phthalazinedione),是一種脂溶性的發(fā)光劑,氧化后生成魯米諾自由基而化學(xué)發(fā)光,具有460nm左右峰值的帶狀光譜,肉眼可觀察到鮮明的紫藍色。魯米諾以單價氧化形式與超氧自由基陰離子反應(yīng),產(chǎn)生不穩(wěn)定性內(nèi)過氧化物或二氧環(huán)丁烷(Dioxetane),由此分解成電激發(fā)狀態(tài),通過釋放光子,回復(fù)到基態(tài)。魯米諾作為探針,可以檢測細胞內(nèi)外過氧化氫、超氧自由基陰離子和羥自由基,其中過氧化氫Z強,其發(fā)光強度與過氧化氫水平成正相關(guān)。產(chǎn)品內(nèi)容清理液(ReagentA)毫升強化液(ReagentB)毫升發(fā)光液(ReagentC)毫升產(chǎn)品說明書1份保存方式保存強化液(ReagentB)和GENMED發(fā)光液(ReagentC)在-20℃冰箱里,嚴格避免光照;其余的保存在4℃冰箱里,有效保證6月用戶自備15毫升錐形離心管:用于精子細胞操作的容器培養(yǎng)箱:用于精子細胞孵育1血細胞計數(shù)器:用于精子細胞計數(shù)臺式離心機:用于沉淀精子細胞測試管:用于發(fā)光檢測用的專用試管化學(xué)發(fā)光儀:用于檢測化學(xué)發(fā)光實驗步驟一、樣品預(yù)處理1.移取2毫升新鮮收集(1小時內(nèi))的精液到15毫升錐形離心管2.放進37℃培養(yǎng)箱孵育20分鐘3.放進臺式離心機離心7分鐘,速度為300g4.小心抽去上清液5.加入xx毫升清理液(ReagentA),混勻精子細胞顆粒群6.放進臺式離心機離心7分鐘,速度為300g7.小心抽去上清液8.重復(fù)實驗步驟5至7一次9.加入適量的清理液(ReagentA)10.充分混勻后,在血細胞計數(shù)器上進行精子細胞計數(shù)11.調(diào)整精子細胞數(shù)為20X106/毫升12.放進37℃培養(yǎng)箱里備用(1小時內(nèi))二、測讀測讀開始前,打開化學(xué)發(fā)光儀,設(shè)定儀器內(nèi)溫度為37℃預(yù)熱和整合測讀10秒或15分鐘;然后關(guān)掉實驗室的燈光。將-20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化,嚴格置于暗室里。然后進行下列操作。1.準備好測試管,做好標記:陰性對照、樣品本底和樣品活性2.移取xx微升清理液(ReagentA)到陰性對照測試管3.移取xx微升上述預(yù)處理的精子細胞到樣品本底測試管4.移取xx微升上述預(yù)處理的精子細胞到樣品活性測試管5.分別加入xx微升強化液(ReagentB)到上述測試管,除樣品本底測試管外6.分別加入xx微升發(fā)光液(ReagentC)到上述測試管,除樣品本底測試管外7.輕輕渦旋混勻8.即刻放進37℃化學(xué)發(fā)光儀里測讀9.整合測讀10秒,獲得相對發(fā)光單位(relativelightunit;RLU)10.或者整合測讀15分鐘,獲得光電子讀數(shù):X106CPM(countedphotonperminute)(注意:可以使用液體閃爍儀替代)11.計算ROS水平:(樣品活性-樣品本底)÷6精子細胞=X106CPM/毫升=X106CPM/20X106精子細胞注意事項21.本產(chǎn)品為50次操作2.如果測定體系變化,則試劑用量相應(yīng)變化3.操作時,須戴手套4.測試前,精子細胞須新鮮收集,1小時內(nèi)為**5.精子細胞懸液制備后即刻測讀,不宜過*保存6.精子細胞懸液須清澈7.如果需要排除白細胞的干擾,建議純化精子細胞:精子細胞高純分離試劑盒(14003)8.如果需要區(qū)分精液各種成分的活性氧生成情況,建議使用精液組分氧化應(yīng)激活性氧(ROS)魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑盒(10112.3.2)9.本產(chǎn)品適合凍存的精子細胞檢測10.測讀的所有步驟均須在暗室里進行11.如果是注射式化學(xué)發(fā)光儀,建議測試前后使用無離子水沖洗化學(xué)發(fā)光儀注射(injector)管道12.正常精子細胞ROS水平是0.1至1.0X106CPM/2X106精子細胞13.本公司提供系列精子細胞分析試劑產(chǎn)品質(zhì)量標準1.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定2.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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