本文由 上海恒遠ELISA試劑盒供應商 整理匯編

2018-11-16 10:02 1859閱讀次數

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• 基因組DNA文庫構建必備實驗技巧

  基因組DNA文庫構建必備實驗技巧基因組DNA文庫用途十分廣泛,如用于人類及動植物基因組學研究,基因表達調控研究,分析、分離特定的基因片段等.通常情況下,基因組文庫構建的基本流程可以歸為四大步驟：分離基因組DNA、對基因組DNA作相關的處理、將基因組DNA片段連接入載體、將重組載體轉入宿主細胞.一、分離基因組DNA（gDNA）毫無疑問,高質量的基因組DNA對于基因組文庫構建是至關重要的.需要通過經驗來選擇合適的基因組DNA分離方法,在分離過程中保證DNA不被過度剪切或降解,同時也要盡量保證DNA的純度.二、處理基因組DNA根據研究目的,研究者需要選擇合適的載體.不同的載體對基因組DNA的長度有不同的要求,必須選擇合適長度的基因組DNA來構建基因組文庫.比如,對于黏粒載體,合適的片段長度大約為40kb；對于BAC載體,合適的片段長度平均為120kb-300kb.構建黏粒基因組DNA文庫,需要將基因組DNA用注射器抽打來隨機剪切DNA；接著用末端修復酶修復DNA,可以提高DNA連接入載體的效率；然后通過脈沖場電泳或者普通電泳來找到40kb左右的DNA片段,隨后使用膠回收試劑盒回收DNA.構建BAC基因組DNA文庫,需要將基因組DNA用限制性內切酶（常用EcoRI、BamHI或者HindIII）來消化基因組DNA,然后通過脈沖場電泳找到合適長度的DNA片段（比如100kb-150kb）,隨后透析回收DNA.需要注意：（1）電泳時,要選用合適的DNALadder,以保證電泳后可以準確定位所需分子量的DNA.（2）電泳以后,應盡量縮短用紫外光照射目標DNA的時間,否則會顯著降低克隆效率.（3）回收DNA的時候,應該要避免過度離心,以防止DNA被剪切,降低文庫質量.三、載體的選擇目前,常用的基因組文庫載體有黏粒載體、P1噬菌體載體、PAC載體（P1人工染色體）、BAC載體（細菌人工染色體）和YAC載體（酵母人工染色體）.選用何種載體可以參考如下幾個因素：1、目標區(qū)域的大小：如果基因組的目標區(qū)域很?。ㄐ∮?0kb）,那么可以選擇黏粒載體甚至λ噬菌體載體.利用現有的商品化的黏粒載體、GX率的包裝混合物和合適的大腸桿菌菌株,可以方便的構建黏粒載體文庫.如果基因組的目標區(qū)域比較大,那么P1、PAC或者BAC就比較合適了.P1操作比較困難,PAC相對簡便.BAC載體也是很好的選擇,可以利用現有的成熟產品來構建BAC文庫,比如商業(yè)化的一系列BAC載體及配套試劑盒.如果目標區(qū)域非常大（大于250kb）,那么YAC載體就是了.不過,應用YAC載體來構建基因組文庫,操作非常繁瑣困難.表1各種載體的比較載體容量（kb）宿主導入細胞方式黏粒30-45大腸桿菌轉導P170-100大腸桿菌轉導PAC130-150大腸桿菌電轉BAC120-300大腸桿菌電轉YAC250-400酵母轉化2、篩選文庫的難易程度：黏粒載體一般使用傳統(tǒng)的濾膜影印雜交來篩選,但是這種方法對于構建區(qū)域圖譜及疊連群來說既費力又浪費.大容量載體文庫,如P1、PAC、BAC、YAC,以二維陣列保存,既可以用傳統(tǒng)的單拷貝的探針雜交法篩選,又可以用PCR進行多克隆的群體篩選.而且,使用高容量載體構建文庫,可以減少染色體步查的步驟.3、載體拷貝數的考慮：當把大片段DNA片段克隆到高拷貝的載體時,克隆DNA會發(fā)生重組,從而影響克隆序列的保真性和穩(wěn)定性；而單拷貝載體的低產量DNA是高通量分析的瓶頸.對這一矛盾的解決方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM克隆系統(tǒng),CopyControlTM技術整合了單拷貝載體與多拷貝載體的優(yōu)點.單拷貝載體能提高插入片段的穩(wěn)定性,而且能在誘導劑的作用下,即時擴增出高拷貝數的克隆而獲得高產量的DNA.四、將基因組DNA片段連接入載體使用連接酶把上述大小合適的DNA片段連接入載體.許多商業(yè)化載體已經經過預處理,可以直接使用,無需內切酶消化及脫磷酸化處理.選用連接快、效率高的連接酶,連接反應體系以100μl為宜.注意：BAC載體連接完以后,需要將連接產物做脫鹽處理,除去連接反應緩沖液里的鹽分.五、將重組載體轉入宿主細胞如果構建黏粒文庫,需要用包裝蛋白來包裝上述的連接反應產物,測定包裝好的黏?？寺〉牡味?然后轉染.挑出重組子,鑒定插入片段的大小.如果文庫的大小和質量都令人滿意的話,就可以鋪板進行文庫篩選,或者擴增、保存文庫.如果構建BAC文庫,應選擇電轉法,將上述連接產物轉入受體菌,涂板長出克隆.獲得克隆后需要對BAC克隆的大小進行評估,確定文庫大小是否能夠滿足要求.如果文庫大小合適,就可以進行后續(xù)操作了.六、文庫克隆數的確定基因組DNA文庫需要包含足夠多的克隆,來保證文庫的代表性.一般使用如下的經驗公式來確定：N=ln（1-P）/ln（1-f）P是希望得到的覆蓋率,f是插入片段大小與基因組DNA大小的比值,N是所需的克隆數.舉例來說,用BAC載體構建人類基因組文庫,人類基因組大小為3x109bp,插入片段大小為100kb,希望覆蓋率99%,那么所需要的BAC克隆數為N=ln（1-0.99）/ln（1-[106bp/3x109bp]）=138,298技術支持資料：材料緩沖液和溶液-堿裂解液I,4°C50mM葡萄糖25mMTris-Cl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）配制堿裂解液I約100ml,滅菌,保存在四度.-堿裂解液II,新鮮配置,室溫保存0.2NNaOH（從10N的NaOH新鮮制備）1%（w/v）SDS堿裂解液II應該新鮮配制,室溫保存.-堿裂解液III,4°C5M醋酸鉀,60ml冰醋酸,11.5mlSDW,28.5ml-酒精-70%酒精-異丙醇-酚：氯仿（1：1,v/v）-醋酸鈉（3M,pH5.2）-STE,4°C10mMTris-Cl（pH8.0）0.1MNaCl1mMEDTA（pH8.0）-TE（pH8.0）10mMTris-Cl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）載體與菌株BAC轉化的大腸桿菌培養(yǎng)基和抗生素含12.5μg/ml氯霉素的LB平板和液體培養(yǎng)基酶和緩沖液溶菌酶RNaseA,不含DNase限制性內切酶和相應緩沖液核苷酸/寡核苷酸用于脈沖場凝膠電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis）的DNA標準參照物凝膠/點樣緩沖液脈沖場凝膠電泳（Pulsed-fieldgels,或者0.5%瓊脂糖凝膠）離心機/轉頭/離心管其他37攝氏度搖床1.BACDNA大量提取方案（參考文獻：Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition）此方案適合從500ml的菌液中提取BACDNA,一般可以產生20-25μg純化的DNA.方法1.將50μlBAC轉化菌的過夜培養(yǎng)物接種到500ml含12.5μg/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃震蕩（280rpm）培養(yǎng)12到16小時.2.2500g,4℃,離心15min,收集菌體.3.用100ml冰預冷的STE重新懸浮細菌沉淀.按步驟2方法離心收集細菌.4.用24ml含RNase（100μg/ml）的堿性裂解液I溶解細菌.加溶菌酶至終濃度為1mg/ml.5.加入24ml新鮮配置的堿性裂解液II.蓋緊離心瓶蓋,輕輕翻轉瓶子數次,使內容物完全混勻,冰裕5min.6.加入24ml冰預冷的堿性裂解液III,蓋緊瓶蓋,輕輕翻轉瓶子數次,使內容物完全混勻,置冰上5min.7.15000g,4℃,離心10min,將上清轉移到另一離心瓶中,棄沉淀.8.加等體積的酚：氯仿.輕輕翻轉離心瓶數次,混勻.3000g,室溫離心15min.9.將水相移至另一離心瓶中,加入等體積的異丙醇,翻轉離心瓶數次,混勻.10.15,000g,室溫離心15分鐘,回收核酸沉淀.11.棄上清,用20ml70%乙醇漂洗沉淀.12.棄乙醇,風干使乙醇揮發(fā)殆盡.13.小心將BACDNA沉淀溶于0.2mlTE（pH8.0）中.2.BACDNA的小量提取（參考文獻：Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition）此方案適合從5ml菌液中提取BACDNA,一般可以產生0.1-0.4μg的BACDNA.方法：1.挑取單菌落接種至5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃劇烈震搖過夜.2.2000g,4℃,離心5min,收集菌體.3.在每個離心管中加5ml預冷的STE,用移液器吹懸細菌沉淀.按步驟2離心收集細菌.4.將菌體重懸于200ul冰冷的堿性裂解液I中.將菌體轉移至預冷的微量離心管中,置于冰上.5.向管中加入400μl新鮮配置的堿性裂解液II.輕輕翻轉數次,將離心管置于冰上.6.向管中加入300μl冰冷的堿性裂解液III,輕輕翻轉數次.將離心管置于冰上5min.7.在微量離心機上以Zda速度4℃離心5min,除去細胞碎片沉淀.將上清移入一新的微量離心管中.室溫下加入900μl異丙醇,輕輕翻轉數次離心管,混勻.8.立即在微量離心機上室溫下Zda速離心5min,使核酸沉淀.棄去上清,用1ml70%乙醇小心漂洗.室溫下離心2min,吸去乙醇.室溫干燥沉淀5-10min后,將沉淀溶于50μlTE（pH8.0）中.[詳細]

  2018-11-16 10:02

  產品樣冊

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• Eppendorf 工作站NGS文庫構建方案

  高質量的下一代測序 (NGS) 文庫的制備是一個復雜的過程，需要投入大量時間、經費和專業(yè)知識。珍貴樣品通常要處理多日（取決于所用試劑盒），直至準備好文庫進行測序。完整的方法由多個部分組成，每個都有特有的精度要求和數百個移液步驟。由于移液精度取決于用戶，因此導致了不穩(wěn)定性，這對重復性產生了負面影響。 Eppendorf epMotion? 自動移液工作站可以用極少的用戶干預和設定時間來簡化這個費力的過程，即使是對于樣本數量較少的操作也可使用。為了盡可能減少編程并讓您快速啟動和運行，Eppendorf 提供了經過預先優(yōu)化和試劑廠家認可的 NGS 試劑盒方法，這將獲得可重復的優(yōu)質的二代測序文庫。[詳細]

  2023-09-15 15:01

  應用文章

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• 細菌基因組DNA純化試劑盒

  本公司新推出的全新細菌基因組純化試劑盒，操作簡便，純化量大，可純化革蘭氏陽性和陰性菌的基因組DNA。細菌基因組DNA提取試劑盒使用說明本試劑盒可用于革蘭氏陰性和陽性菌的基因組DNA提取，由細菌重懸液、裂解液、蛋白沉淀液以及DNA溶解液組成?？蓮?-5ml菌液中提取基因組DNA。整個提取過程不超過45分鐘。提取過程包括：1菌液離心，重懸。2裂解菌體，釋放基因組DNA。3鹽析沉淀蛋白，分離DNA。4異丙醇沉淀脫鹽并濃縮。570%乙醇清洗，晾干并用DNA溶解液溶解。本試劑盒采用復合裂解液，其中含有YZDNA酶的成分，在加熱（65°C）狀態(tài)下，可保證完整的細菌基因組DNA的充分裂解釋放，本試劑盒即可提取異丙醇沉淀時，罕見渾濁的蛋白質雜質的共沉淀。提取的基因組可用于PCR擴增、內切酶消化以及膜雜交等。一、試劑盒組成（本試劑盒提供的組份,至少可提取100份1-5ml菌液基因組DNA的純化，每種組份均有足夠的富余量）1．復合裂解液：30ml1瓶。2．蛋白沉淀液：300ml1瓶。3．DNA溶解液：20ml1瓶。4．操作說明書一份。二、本試劑盒未提供，須用戶自備的試劑為：異丙醇，70%乙醇（國產分析純）。三、提取操作：1．菌液離心：取革蘭氏陰性菌菌液1-2ml；或者革蘭氏陽性菌菌液2-5ml，1000rpm離心1分鐘。2．加入細菌重懸液100ul，震蕩使菌體重懸。3．將復合裂解液置65°C水浴加熱，使結晶成分溶解，每個細菌重懸液中分別加入300ul的復合裂解液。4．混璇器震蕩混勻10秒，置65°C水浴中反應10分鐘（革蘭氏陰性菌），20分鐘（革蘭氏陽性菌）。5．各管中加入300ul蛋白沉淀液。上下顛倒5-6次使兩者混勻。6．13000-16000×g,離心3-5分鐘。7．將上清液轉移至新的離心管中（注意：由于有些細菌含有多糖或者脂蛋白成分，離心后會出現細胞成分上浮的情況，此時取漂浮層下的均一透明液體），加入等體積異丙醇，此時可見透明的絮狀物，混勻后離心，同步驟5，吸去上清。8．離心管中加入200ul，70%的乙醇溶液，來回倒置，清洗管壁，離心同上。9．移去70%乙醇，倒置離心管于干凈的濾紙上，自然干燥10-15分鐘，加入DNA溶解液100ul。10．快速漩渦震蕩1-2秒，使DNA溶解液沖刷到所有沉淀的DNA。11．將純化的全血基因組置65C水浴1小時，或4C過夜使DNA充分溶解（要求不嚴格的PCR試驗可縮短時間或省去該步），輕輕彈動管壁有助于溶解基因組DNA可直接進行PCR等下一步操作。四、注意事項：1.用戶可選擇使用RNaseA,使用方法為：在第3步完成后1.5ulRNaseA,混勻后，37C孵育15分鐘，冷卻至室溫。（RNaseA的配法：將RNaseA溶于TEbuffer中，濃度為4mg/ml,煮沸10分鐘，以去除DNase,分裝后-20C保存；也可購買配好的試劑使用。）2.革蘭氏陽性菌由于細胞壁的存在，純化的量較陰性菌要少一倍以上。3.提取得DNA樣本在70%乙醇中，存于-80C，可長期保存。五、儲存條件：本試劑盒在室溫條件下可保存一年。[詳細]

  2024-09-29 11:00

  產品樣冊

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• 病毒基因組提取試劑盒（DNA）說明書

  病毒基因組提取試劑盒（DNA）說明書[詳細]

  2016-05-25 00:00

  操作手冊

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• 用 Retsch MM301基因組DNA快速提取

  用 Retsch MM301基因組DNA快速提取[詳細]

  2007-03-15 00:00

  實驗操作

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• 病毒基因組提取試劑盒（DNA/RNA)說明書

  病毒基因組提取試劑盒（DNA/RNA)說明書[詳細]

  2016-05-25 00:00

  產品樣冊

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• 實時定量PCR實驗技巧

  實時定量PCR實驗技巧[詳細]

  2016-05-03 00:00

  安裝說明

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• 做實驗時馬弗爐使用技巧

  做實驗時馬弗爐使用技巧[詳細]

  2012-08-22 00:00

  報價單

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• 做實驗的十八般技巧---實驗室材料

  做實驗的十八般技巧---實驗室材料[詳細]

  2007-11-07 00:00

  操作手冊

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• 質粒構建

  質粒構建[詳細]

  2024-09-20 13:38

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• 酵母雙雜交的實驗步驟和技巧分析

  LexA酵母雙雜交系統(tǒng)簡介一、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)的設計原理報告質粒p8op-LacZ的GAL4UAS編碼序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活劑的情況下，報告基因LacZ的轉錄活性為零，該基因的篩選標志為URA3，可以作為有自主復制能力的質粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因組DNA上。質粒pLexA的篩選標志為HIS3，在雙雜交系統(tǒng)中用于表達DNA-BD（202個氨基酸殘基組成的LexA蛋白）與目標蛋白（釣餌，Bait）的融合蛋白，該融合體的表達受酵母強啟動子ADH1的調控，選擇與報告基因的操縱子LexA×8結合。質粒pB42AD的篩選標志為TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位點（EcoRI與XhoI）上游，含有SV40核定位（SV40nuclearlocalization）、HA（血凝素）及AD（來自于E.coli的88個氨基酸殘基組成的B42蛋白）等幾種編碼序列，共同組成可以啟動報告基因轉錄表達的激活成份。在酵母EGY48的基因組中還整合有另一個報告基因Leu，它與LacZ報告基因具有相同的操縱子-LexA，但兩者啟動子不同。根據雙雜交系統(tǒng)的原理，如果某一復合物同時具有DNA-BD和AD的活性，即可激活報告基因的轉錄和表達。分別將待測蛋白X、Y的編碼序列插入pLexA質粒載體和pB42AD質粒載體的多克隆位點中，然后共同轉入含有報告基因的酵母菌株，如果蛋白X與Y能相互作用，則啟動報告基因的轉錄和表達，通過檢測報告基因的表達情況，就可以間接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的強弱。如果將蛋白Y換為取自組織或血液的cDNA文庫，則可用X從該文庫中篩選出能與其相互作用的蛋白，并且可以獲得編碼這些蛋白的cDNA。二、商品化酵母雙雜交系統(tǒng)的組成1.載體質粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文庫2.酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侶菌株）3.大腸桿菌菌株：E.coliKC8株4.對照質粒：質粒用途pLexA-53，pB42AD-T陽性對照pLexA-Pos（LexA/GAL4AD融合蛋白〕陽性對照pLexA-Lam（LaminC蛋白少與其它蛋白相互作用）假陽性檢測質粒5.引物：pLexA測序引物及pB42AD測序引物。三、酵母雙雜交實驗的基本流程1.將報告基因p8op-LacZ轉化酵母EGY48菌株，用培養(yǎng)基SD/-Ura篩選。2.同時構建或擴增DNA文庫，并純化足夠的質粒以轉化酵母細胞。3.構建DNA-BD/靶蛋白質粒pLexA-X，作為釣餌（bait）。4.將上述釣餌質粒pLexA-X轉化EGY48（p8op-LacZ）細胞株，用SD/-His/-Ura篩選;并用固體誘導培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Ura檢測此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活報告基因的活性，以及對酵母細胞是否具有殺傷毒性。轉化質粒選擇培養(yǎng)基克隆生長情況說明（含有Gal/Raf）pLexA-PosSD/-His，-Ura藍陽性對照pLexASD/-His，-Ura白陰性對照PlexA-XSD/-His，-Ura白沒有直接激活活性PlexA-XSD/-His，-Ura藍具有直接激活活性PlexA-XSD/-His，-Ura菌落不能生長酵母細胞毒性4-1.如果pLexA-X-半乳糖苷酶的信號作用。b能夠自動激活報告基因，則設法去除其激活活性部位、或者將LacZ報告基因整合入基因組，減少4-2.如果pLexA-X雖然不會自動激活報告基因，但對酵母宿主細胞有毒性，則需要與純化的文庫DNA同時轉化酵母。5.如果pLexA-X既不會自動激活報告基因，也不具有毒性，則可以與純化的文庫DNA同時、或順序轉化酵母細胞，并檢測質粒轉化效率。轉化質粒SD固體培養(yǎng)基LacZ表型對照1pLexA-PosGal/Raf/-His/-Ura藍對照2pLexA-53Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu藍+pB42AD-T實驗pLexA-XGal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu待測+pB42AD-文庫5-1.用SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基選擇陽性共轉化子，并擴增，使宿主細胞中的質粒在誘導前達到Zda拷貝數。-半乳糖苷酶無表達。b5-2.上述重組子轉至含X-gal的固體誘導培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，觀察LacZ及Leu報告基因的表達情形，藍色克隆即為陽性。白色克隆為假陽性，說明Leu雖有表達，但5-3.同時用LacZ、Leu兩個報告基因的目的，是為了盡可能消除實驗的假陽性誤差，譬如：AD融合蛋白不與目標蛋白結合，而直接與啟動子序列結合域結合等情況。由于2個報告基因的啟動子不同，出現上述假陽性的幾率就大大減少了。5-4.將藍色陽性克隆進行1次以上的劃種，盡可能分離克隆中的多種文庫質粒。6.陽性克隆的篩選6-1.隨機選取50個陽性克隆，擴增、抽提酵母質粒，電轉化E.coliKC8宿主菌，抽提大腸桿菌中的質粒，酶切鑒定是否具有插入片段及排除相同的文庫質粒。6-2.如果重復的插入序列較多，可另取50個陽性克隆來分析。Z后得到數種片段大小不同的插入序列，再轉化新的宿主細胞，檢測是否仍為陽性克隆。7.用質粒自然分選法（NaturalSegregation）篩除只含有AD-文庫雜合子的克隆7-1.將初步得到的陽性克隆接種SD/-Trp/-Ura液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1-2天，含有HIS3編碼序列的BD-靶質粒在含有外源His培養(yǎng)基中，將以10%-20%左右的頻率隨機丟失。C孵育2-3天。°7-2.將上述克隆，轉鋪固體培養(yǎng)基SD/-Trp/-Ura，307-3.再挑取生長的單克隆，轉入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基中，篩選His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文庫雜合子的重組子。7-4.將His表型缺陷的克隆轉化固體誘導培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以驗證AD-文庫能否直接激活報告基因的表達，棄去陽性克隆，保留陰性克隆。8.酵母雜合試驗（YeastMating）確定真陽性克隆如下表所示，在酵母EGY48及其對應的YM4271宿主細胞中分別轉入相應的質粒或文庫DNA，通過雜合實驗確篩選pLexA-靶DNA與pB42AD-文庫確實具有相互作用的真陽性克隆。質粒1（inYM4271）質粒2（inEGY48）LacZ表型Leu表型pLexApB42AD白不能生長pLexA-靶DNApB42AD白不能生長pLexApB42AD-文庫白不能生長pLexA-靶DNApB42AD-文庫藍真陽性pLexA-LampB42AD-文庫白不能生長9.陽性克隆的進一步篩選和確證9-1.擴增初步確定的陽性克隆，抽提酵母DNA。該DNA為混合成份，既含有酵母基因組DNA，也含有3種轉化的質粒DNA。9-2.將上述DNA電轉化E.coliKC8宿主菌。由于在大腸桿菌中，具有不同復制起始調控序列的質粒不相容;同時利用營養(yǎng)缺陷型篩選。因此，在M9/SD/-Trp培養(yǎng)基上，只有含有AD-文庫質粒的轉化菌才能生長，將其擴增、并抽提質粒DNA，酶切鑒定。9-3.用pLexA-靶DNA與pB42AD-庫DNA一一對應、共轉化只含有報告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板擴增，并與后面的誘導板形成對照，說明報告基因的表達與誘導AD融合蛋白的表達有關，再確證LacZ、Leu報告基因的表達。9-4.擴增與靶DNA相互作用的文庫DNA，進行序列分析及進一步的結構、功能研究。10.對雙雜交系統(tǒng)陽性結果的進一步研究10-1.用不同的雙雜交系統(tǒng)驗證10-1-1.將載體pLexA與pB42AD互換后進行雙雜交實驗。10-1-2.選擇不同的雙雜交系統(tǒng)，如：以GAL4轉錄激活子為基礎的雙雜交系統(tǒng)。10-1-3.將文庫質粒移碼突變后，再與靶質粒作用，報告基因是否仍能被激活。-半乳糖苷酶水平，比較作用強度變化。b10-1-4.去除或突變特定結合位點，定量檢測10-2.用試劑盒提供的引物測定插入片段的DNA序列，證明其編碼區(qū)域。10-3.用其它的檢測方法，如：親和色譜法或免疫共沉淀法來證明雙雜交系統(tǒng)篩選的蛋白之間的具有相互作用。10-4.進一步研究靶蛋白與篩選蛋白之間的功能關系構建于AD載體的cDNA文庫的擴增1.自-80℃冰箱取出含有cDNA文庫的甘油菌，置于冰浴中緩慢化凍。2.用新鮮的LB培養(yǎng)液在1.5ml離心管中將上述甘油菌1:106和1:108稀釋。lml加入90m3.取稀釋菌液各1090mm）;37℃倒置培養(yǎng)過夜或30℃培養(yǎng)24-36hr，計數平板上單克隆菌落數。fLB培養(yǎng)液在1.5ml離心管中振蕩混勻，涂布LB/Amp平板（4.確定待擴增的cDNA文庫滴度（cfu/ml）=克隆數×108（1:106稀釋）或克隆數×1010（1:108稀釋）。5.按照>150mm），共100塊;37℃倒置培養(yǎng)過夜。f2-4×104cfu/平板的濃度，涂布LB/Amp平板（6.在超凈工作臺上，在所有生長菌落的平板上加適量LB培養(yǎng)液，將菌落刮下，轉入2000mlLB/Amp培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)2-4hr。7.留取適量培養(yǎng)菌液以50%無菌甘油稀釋至25%終濃度，分裝，保存于-80℃。8.其余培養(yǎng)菌液離心8000xg×10min，4℃收集細菌;用質粒DNA純化試劑盒大量抽提質粒DNA。LB液體培養(yǎng)基，121℃，15lb/in2滅菌15minA.bacto-Tryptone10.0gB.bacto-YeastExtract5.0gC.NaCl10.0gD.ddH2O→1000ml*LB固體培養(yǎng)平板為含有1.5%瓊脂（Agar）LB培養(yǎng)基。**LB/Amp培養(yǎng)基為含有Ampg/ml的LB培養(yǎng)基。m50-100構建于AD載體的cDNA文庫的純化1.質粒DNA提取緩沖液名稱緩沖液配方g/mlRNasemP1懸浮緩沖液50mMTris-HCl（pH8.0）;10mMEDTA;100AP2裂解緩沖液200mMNaOH;1%SDSP3中和緩沖液3.0MKac（pH5.5）QBT平衡緩沖液750mMNaCl;50mMMOPS（pH7.0）;15%異丙醇;0.15%TritonX-100QC洗滌緩沖液1.0MNaCl;50mMMOPS（pH7.0）;15%異丙醇QF洗脫緩沖液1.25MNaCl;50mMTris-HCl（pH8.5）;15%異丙醇2.培養(yǎng)菌液離心6000xg×10min，4℃，每500ml培養(yǎng)物（下同）的沉淀重懸于50mlP1緩沖液。3.加入50mlP2緩沖液，倒置4-6次混勻，室溫孵育5min。4.加入4℃預冷的50mlP3緩沖液，快速倒置4-6次混勻，冰浴30min（其間再倒置混勻4-6次）。5.將上述混合液再倒置混勻，離心12000xg×30min，4℃，保留上清。6.上清再離心12000xg×15min，4℃，留上清。7.將上清液上樣于經35mlQBT緩沖液平衡的QIAGEN-tip層析柱。8.以100mlQC緩沖液洗滌層析柱2次。9.以35mlQF緩沖液洗脫吸附于層析柱上的DNA。10.以0.7倍體積異丙醇沉淀DNA，離心12500xg×30min，4℃，小心去除上清。11.以7ml70%乙醇洗滌沉淀DNA，離心12500xg×10min，4℃，小心去除上清。12.將沉淀的質粒DNA溶于5mlTE（pH8.0）緩沖液，轉移至新的無菌離心管中，用2.5倍體積無水乙醇;1/10體積3.0MNaAc（pH5.2），于-20℃靜置過夜。13.離心12500xg×20min，4℃，去除上清，沉淀用70%乙醇洗滌，超凈臺風干。l），保存于-20℃。mg/管（用于1次轉化反應，約40m14.干燥的DNA溶于適量體積TE，定量，分裝100-200構建于DNA-BD載體的目的DNA轉化酵母感受態(tài)細胞1.將酵母菌EGY48（p8op-lacZ）接種于5.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉入95.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Trp5.0mlG.ddH2O→100.0ml2.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml3.室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細胞。4.準備下列試劑2×轉化反應10×TE10×LiAc50%PEGddH2Olml/120ml15mA.1×TE/LiAc0.15ml15l/ml960ml120mB.PEG/LiAc1.20ml120lml//900mC.1×TE1.00ml1005.分裝待轉化的質粒DNA，振蕩混勻。lmg）3-5mA.pLexA-X（0.1B.10mg/mllmSpermDNA*（0.1mg）10*新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細胞，振蕩混勻。m6.每管加入100lm7.各加入600PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。lm8.各加入70DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。9.室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清;以0.3ml1×TE重懸沉淀細胞，涂布SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen1.34gB.葡萄糖4.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）20.0mlD.20×Leu10.0mlE.20×Trp10.0mlF.Agar4.00gG.ddH2O90-100mm）f→200.0ml鋪8-10塊平板（附表1.不同規(guī)模轉化酵母感受態(tài)細胞SmallScale*LargeScaleLibraryScale轉化反應2011（1）SD液體培養(yǎng)基擴增酵母菌100ml100ml300ml（2）YPD液體培養(yǎng)基擴增酵母菌300mla300mla1000mla（3）TE或ddH2O洗滌酵母細胞15mlc25-50mlb500mla（4）準備A.1×TE/LiAc緩沖液1.5mld1.0mld8.0mlcB.PEG/LiAc緩沖液12.0mlc6.0mlc100.0mlbC.1×TE緩沖液6.0mlc10.0mlc10.0mlc（5）分裝A.DNA-BDvectorgd×20/0.2-1.0mgcm0.1gd0.1-0.5mgmg×2010-50mB.ADvector0.1C.l2.0mlml×20200mSpermDNA（10mg/ml）101×TE/LiAc重懸感受態(tài)細胞1.5mlc1.0mlc8.0mlbl×201.0ml8.0mlm酵母感受態(tài)細胞100（7）PEG/LiAc緩沖液0.6ml×206.0ml60.0mll7.0mlml×20700mDMSO70（9）室溫離心后棄上清13000xg×10sec2000xg×5min2000xg×5min（10）1×TE重懸感受態(tài)細胞0.3ml×206.0ml10.0ml150mm×50f150mm×30f90mm×20f鋪固體選擇培養(yǎng)基平板注:*即為“構建于DNA-BD載體的目的DNA轉化酵母感受態(tài)細胞”**在不同容積的無菌離心管中進行，a:300或500ml;b:50ml;c:15ml;d:1.5ml文庫cDNA轉化含有DNA-BD載體的酵母感受態(tài)細胞1.以生長于SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板上的含有構建于DNA-BD載體的目的DNA及報告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作為宿主菌，制備酵母感受態(tài)細胞。2.將酵母宿主菌接種于5.0mlSD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉入95.0mlSD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×Leu5.0mlE.20×Trp5.0mlF.ddH2O→100.0ml3.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml4.室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細胞。5.準備下列試劑1×轉化反應10×TE10×LiAc50%PEGddH2Olml/800ml100mA.1×TE/LiAc1.0ml100l4.8ml/ml600mB.PEG/LiAc6.0ml600C.1×TE10.0ml1.0ml//9.0ml6.取1.0ml用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細胞，加入下列成份，振蕩混勻。lmg）40mA.pB42AD-Library（50-100B.10mg/mllmHerringDNA*（2.0mg）200*新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。7.加入6.0mlPEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。lm8.加入700DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。9.室溫離心2000xg×5min，盡量棄上清。10.以6.0ml100mm，每稀釋度各×2），30℃倒置培養(yǎng)3-5天，確定轉化效率在2×106cfu以上有效。fl稀釋不同倍數，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m1×TE重懸沉淀細胞，取10150mm×30），30℃倒置培養(yǎng)3-5天。fl涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m11.按每板200SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen13.40gB.葡萄糖40.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）200.0mlD.20×Leu100.0mlE.Agar40.00gF.ddH2O150mm）f→2000.0ml鋪30塊平板（12.在超凈工作臺上，在所有生長菌落的平板上各加5mlTE（pH7.0）緩沖液，將菌落刮下。13.離心棄上清，加入10-20mlTE緩沖液重懸沉淀菌，加入等體積的無菌65%甘油-MgSO4緩沖液，混勻，分裝1.0ml/管，保存于4℃1周或-80℃1年以上。65%甘油-MgSO4緩沖液:65%甘油;100mMMgSO4;25mMTris-HCl（pH8.0）A.甘油65.00mlB.MgSO47H2O2.465gC.2.0MTris-HCl（pH8.0）1.25mlD.ddH2O→100.00ml酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的篩選1.經過選擇培養(yǎng)基篩選的含有DNA-BD載體、文庫DNA及報告基因的酵母感受態(tài)細胞，用無菌TE稀釋至1:104、1:106和1:108等不同濃度。90mm），30℃倒置培養(yǎng)3-5天，計數平板上單克隆菌落數。fl，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m2.取上述稀釋菌液各1003.確定待進一步鑒定的酵母菌滴度（cfu/ml）=克隆數×105（1:104稀釋）、克隆數×107（1:106稀釋）或克隆數×109（1:108稀釋）。4.按照以前實驗確定的文庫轉化效率的5-10倍的總量、0.5-2×106cfu/平板的菌量，涂布SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。5.挑取顯藍色的菌落，再接種于SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基以及SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導培養(yǎng)基，以進一步確證。SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導培養(yǎng)基A.SD/Gal/Raf3.79gB.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlC.Agar2.00gD.ddH2O→85.0ml滅菌（115℃，10lb/in2）15min，冷卻至50℃，加入下列成份后鋪板E.10×BU10.0mlF.20mg/mlX-gal0.4ml90-100mm）f鋪5-6塊平板（10×BU緩沖液，121℃，15lb/in2滅菌15minA.Na2HPO412H2O9.30gB.NaH2PO42H2O3.90gC.ddH2O→100.0ml20mg/mlX-GalA.X-Gal40mgB.DMF2ml酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的鑒定-酵母質粒DNA的提取1.挑取經過酵母選擇/誘導培養(yǎng)基初步鑒定的酵母單菌落，接種于5.0-10.0mlSD/-Trp液體培養(yǎng)基，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)20hr。SD/-Trp液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Ura5.0mlG.ddH2O→100.0ml2.室溫離心5000xg×1min，棄上清，收菌。l酵母裂解液，振蕩重懸沉淀酵母菌。m3.加入200酵母裂解液:2%TritonX-100;1%SDS;100mMNaCl;10mMTris-HCl（pH8.0）;1mMEDTAA.10%TritonX-10020.0mlB.10%SDS10.0mlC.NaCl0.58gD.Tris0.12gE.EDTANa22H2O0.04gF.1.0MHCl調pH8.0G.ddH2O→100.0ml4.加入下列試劑，充分振蕩5min;液氮凍存10min，室溫復融;再充分振蕩5min。A.經酸處理的玻璃珠（Sigma）0.20gB.苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）0.2ml5.室溫離心12000xg×10min，將上清轉移至新的1.5ml離心管中，加入下列試劑，于-70℃凍存30-60min。A.3MNaAc（1/10lmV）20lmB.無水乙醇（2.5V）5006.離心12500xg×10min，4℃，棄上清;70%乙醇洗滌沉淀，于37℃烘箱或超凈臺干燥DNA;將干燥的沉淀DNA重溶于l無菌ddH2O中，保存于-20℃。m20-30酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的鑒定-酵母質粒DNA電轉化大腸桿菌1.在冰浴條件下，取待轉化DNAl感受態(tài)細胞中，混勻。mg），加入100ml（5pg-0.5m1.0WF，200m2.將上述混合液加入間距0.1cm的樣品杯中，電轉化（1.8kV，25。3.迅速加入1ml新鮮的LB培養(yǎng)液，混勻，轉入1.5ml離心管中，37℃恒溫，150rpm振蕩孵育30-60min。4.將上述轉化反應液涂布M9/DO（-Trp）固體培養(yǎng)板，37℃倒置培養(yǎng)至單菌落出現（16-22hr）。5.按常規(guī)方法擴增上述陽性轉化菌，堿裂解法少量抽提質粒DNA，酶切篩選AD載體上含有插入片段的陽性克隆，保存其于25%甘油，待進一步驗證。M9/DO-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.葡萄糖1.2gB.Agar6.0gC.5×M9緩沖液60mlD.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）30mlE.20×His15mlF.20×Leu15mlG.20×Ura15mlH.ddH2O165ml冷卻至50℃左右，加入下列成份，混勻鋪板I.1.0MThiamine-HCl（Vit.B1）0.3mlJ.100mg/mlAmp0.3ml90-100mm）f鋪10-15塊平板（大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備（電轉化）1.挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的E.coliKC8單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜（約12-14hr）。2.將2.5ml新鮮菌液接種于500mlSOB培養(yǎng)液中，37℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5-0.6（約2.5-3hr）。SOB液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.bacto-Tryptone10.00gB.bacto-YeastExtract2.50gC.NaCl0.25gD.KCl0.09gE.MgCl26H2O1.02gF.ddH2O→500.0ml3.將培養(yǎng)菌液收集于離心管中，冰水浴15-20min。4.離心6000xg×10min，4℃，棄盡上清;以5ml預冷的無菌ddH2O重懸沉淀菌;再加入500ml預冷的無菌ddH2O洗滌細菌。5.重復上述步驟1次，以充分去除培養(yǎng)基中殘余的鹽離子成份。6.用40-50ml預冷的無菌10%甘油重懸沉淀細菌，轉移至50ml無菌離心管中;離心6000xg×10min，4℃，棄盡上清;重復此步驟1次。7.以等體積（約1.5-2.0ml）預冷的無菌10%甘油重懸上述沉淀的感受態(tài)細胞，分裝0.5ml/管（5-6次轉化反應），保存于-80℃?zhèn)溆?。酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的確證1.以含有報告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作為轉化宿主菌。2.將酵母宿主菌接種于5.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉入95.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Trp5.0mlG.ddH2O→100.0ml3.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml4.室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細胞。5.準備下列試劑20×轉化反應10×TE10×LiAc50%PEGddH2Ol/1.2mlml150mA.1×TE/LiAc1.5ml150B.PEG/LiAc12.0ml1.2ml1.2ml9.6ml/C.1×TE10.0ml1.0ml//9.0ml6.分裝待轉化的質粒DNA。A.pLexAlmg）3-5morpLexA-X（0.1lmg）3-5mB.pB42AD-Y（0.1C.10mg/mlSpermlmDNA*（0.1mg）10*新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細胞，振蕩混勻。m7.每管加入100lm8.各加入600PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。lm9.各加入70DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。10.室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清;以0.3ml1×TE重懸沉淀細胞，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen3.35gB.葡萄糖10.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）50.0mlD.20×Leu25.0mlE.Agar10.00gF.ddH2O→500.0ml90-100mm）f鋪20-25塊平板（11.挑取上述固體培養(yǎng)基上生長的含有目的DNA（X）的pLexA-X（+）或空載pLexA（-）單菌落，分別接種SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導培養(yǎng)基A.SD/Gal/Raf3.79gB.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlC.Agar2.00gD.ddH2O→85.0ml滅菌（115℃，10lb/in2）15min，冷卻至50℃，加入下列成份后鋪板E.10×BU10.0mlF.20mg/mlX-gal0.4ml90-100mm）f鋪5-6塊平板（12.選擇含有pLexA-X顯藍色，而相應的不含有插入DNA的空載pLexA顯白色的克隆，擴增其在E.coliKC8中的甘油菌，按常規(guī)抽提質粒DNA，進行序列分析。10×DO（-His，-Trp，-Leu，-Ura）為不含His，Trp，Leu，Ura等成份的10×Dropout溶液。每1000ml溶液中含有下列成份，用ddH2O配制后保存于4℃。（1）L-IsoleucineL-異亮氨酸300mg（2）L-ValineL-纈氨酸1500mg（3）Adenine腺嘌呤200mg（4）L-ArginineHClL-精氨酸200mg（5）L-LysineHClL-賴氨酸鹽酸鹽300mgL-MethionineL-甲硫氨酸200mg（7）L-PhenylalanineL-苯丙氨酸500mgL-ThreonineL-蘇氨酸2000mg（9）L-TyrosineL-酪氨酸300mg20×氨基酸儲存液每100ml溶液中分別含有下列成份，配制后保存于4℃。20×HisL-HistidineL-組氨酸40mg20×TrpL-TryptophanL-色氨酸40mg20×LeuL-LeucineL-白氨酸200mg20×UraUracil尿嘧啶40mg酵母轉化緩沖液:緩沖液體積緩沖液配制10×TE100mlTris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O80ml;鹽酸調pH7.5;ddH2O定容10×LiAc100mlLiAc2H2O10.20g;ddH2O50ml，冰醋酸調pH7.5;ddH2O定容50%PEG100mlPEG335050.0g;ddH2O定容其它緩沖液:緩沖液體積緩沖液配制TE1000mlTris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O800ml;鹽酸調pH;ddH2O定容STE1000mlNaCl5.84g;Tris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O800ml;鹽酸調pH8.0;ddH2O定容[詳細]

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  基因組DNA相關基因組DNA提取試劑盒簡介：DNA是遺傳信息的載體，是Z重要的生物信息分子，是分子生物學研究的主要對象，為了進行測序、雜交、基因表達、文庫構建等試驗，獲得高分子量和高純度的基因組DNA是非常重要的前提，因此基因組DNA的提取也是分子生物學試驗技術中Z重要、Z基本的操作之一。Solarbio公司提供各種不同樣品基因組DNA提取試劑盒，如植物、動物、細菌、細胞、血液、酵母等基因組DNA提取試劑盒。所提取的基因組純度高，片段大小在50kb左右。用戶可根據需要選用不同的試劑盒來進行不同樣品的抽提。基因組DNA提取的原則：1、保證核酸一級結構的完整性（因為遺傳信息全部儲存在核酸一級結構中，故完整的一級結構是保證核酸結構與功能研究的基礎）。2、排除其它分子（如蛋白質、多糖、脂類、有機溶劑等）的污染，使下游試驗順利進行?；蚪MDNA提取的原理和方法：DNA與組蛋白構成核小體，核小體纏繞成中空的螺旋管狀結構，即染色絲，染色絲再與許多非組蛋白形成染色體。染色體存在于細胞核中，外有核膜及胞膜。從組織中提取DNA必須先將組織分散成單個細胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色體釋放出來，同時去除與DNA結合的組蛋白及非組蛋白。1、樣品預處理從各種不同來源的樣品（如細菌、酵母、血液、動植物組織細胞等）中提取高純度的基因組DNA，因細胞結構及其成分不同，樣品預處理方式也不同，以下簡單介紹常用提取材料的預處理方式，若需詳細了解，請參考本公司各基因組DNA提取試劑盒說明書。部分樣品預處理方式:植物材料液氮研磨動物材料勻漿、液氮研磨培養(yǎng)細胞蛋白酶K處理細菌溶菌酶破壁酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨血液紅細胞裂解液去紅細胞2、細胞裂解CTAB法：適用于植物組織、真菌等。CTAB是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物。該復合物在高鹽溶液中（>0.7MNaCl）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、多酚等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。SDS法：適用于細菌、血液、酵母、動物組織、細胞等。SDS是一種陰離子去污劑，可溶解細胞膜，裂解細胞，使蛋白質變性、染色體解體。其它裂解方法：物理方式：機械剪切、超聲波破碎、研磨勻漿等化學方式：異硫氰酸胍、堿裂解等酶法：蛋白酶K3、DNA分離純化純化要求：核酸樣品中不應存在對酶（如核酸內切酶、DNA聚合酶等）有YZ作用的成分。其它生物大分子如蛋白質、多糖、多酚和脂類分子等污染應降低到Zdi程度。排除其它核酸分子的污染，如提DNA時應去除RNA，反之亦然。純化方法：細胞破碎后，常使用吸附材料結合方法去除雜質和純化DNA，主要有硅基質材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。因硅基質材料可特異吸附核酸DNA，使用方便、快捷，不需要使用有毒溶劑如酚、氯仿等，使得提取基因組像過濾一樣簡單，因此硅基質材料成為大規(guī)模分離純化DNA的通用方法。硅基質材料吸附核酸的原理：主要利用DNA在高鹽低pH值環(huán)境下與硅基質材料相結合，在低鹽高pH值環(huán)境下與硅基質材料脫離的特征。其機理可能是高濃度鹽離子破壞了硅基質水分子結構，形成陽離子橋，當鹽被清除后，再水化的硅石破壞了基質和DNA之間的吸引力，因而DNA從硅基質上被洗脫下來。注意事項：盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞。減少化學物質對DNA的降解，為避免過酸、過堿對DNA雙鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH值4.0-10.0的條件下進行。防止基因組DNA的生物降解，主要是DNase降解基因組DNA，DNase需二價金屬陽離子如Mg2+等的激活，可用EDTA等金屬離子螯合劑螯合Mg2+以YZDNase的活性。減少物理因素對DNA的降解，物理降解因素主要包括機械剪切力（如劇烈振蕩、攪拌等），細胞突然置于低滲液中導致的細胞爆炸式破裂，DNase大量釋放，樣品反復凍融和高溫等。4、DNA洗脫收集DNA的洗脫效率取決于以下重要因素：洗脫液成分：采用硅基質膜吸附的DNA，可將DNA在低鹽高pH值條件下洗脫下來。pH值在7.0-8.5之間洗脫效率較高，pH值低于7.0則洗脫效率很低。一般基因組提取試劑盒中的洗脫緩沖液就是TE（pH8.0），既為DNA從硅基質膜上洗脫下來提供良好的pH環(huán)境，其中的EDTA又能保證DNA不被DNase降解，同時由于EDTA濃度非常低，對核酸內切酶、DNA聚合酶的影響非常微弱，不影響后續(xù)實驗，可放心使用。洗脫液體積：當洗脫液體積小于30ul時，洗脫效率很低且不穩(wěn)定；當洗脫液體積在50-200ul時，洗脫效率穩(wěn)定在80-90，并可保證得到Zda產量，因此洗脫液體積不能小于30ul。加洗脫液部位：100-200ul洗脫液能完全覆蓋硅基質膜，DNA的洗脫量可得到保證，但當洗脫液體積較少如30-50ul時，須在硅基質膜中間部分懸空滴加洗脫液，以確保少量的洗脫液能完全覆蓋硅膠膜。洗脫液的溫度：在加洗脫液之前，先將洗脫液在60-75℃水浴中預熱10分鐘，可有效提高DNA的洗脫效率。洗脫時間和次數：加入預熱的洗脫液后，可在室溫放置2-5分鐘使DNA完全溶解在洗脫液里通過離心而洗脫下來。同時可進行二次或三次洗脫，即將前次洗脫下來的洗脫液再上柱、離心，使前次沒有洗脫下來的DNA再次溶解在洗脫液里，從而提高DNA的產量。5、DNA的定量及檢測提取得到的DNA*片段需從分子質量、濃度、純度等方面進行檢測，從而判斷DNA質量。用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA分子質量：得到的基因組DNA*片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。Solarbio公司的基因組DNA提取試劑盒提取的不同材料基因組DNA*片段大小一般在50kb左右，能很好地滿足后續(xù)試驗的要求。通常用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA分子質量時，以溴酚藍為示蹤染料，EB染色，紫外觀察，并與DNA分子量標準對照即可判斷所提DNA的平均分子量。高質量的基因組DNA應顯示為單一條帶，如DNA降解則表現為彌散條帶。用紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度：濃度測定：DNA在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA。以下簡單介紹OD260的測定方法：所提基因組DNA樣品=100ul進行OD260值測定的待測樣品=20ul所提基因組DNA樣品+180ulTE=200ulDNA稀釋倍數=200ul/20ul=10倍如200ul待測樣品OD260值=0.2待測樣品濃度（即100ul基因組DNA樣品濃度）=50ug/ml×OD260值×稀釋倍數=100ug/ml所提100ul基因組DNA樣品總量=100ug/ml×100ul=10ugDNA純度測定：一般用OD260/OD280值檢測DNA樣品的純度。正常OD260/OD280值約為1.7-1.9，說明DNA純度較好；若OD260/OD280值小于1.7，說明可能有蛋白污染；若OD260/OD280值大于2.0，說明可能有RNA污染或DNA已經降解。注：因為pH值和離子會影響光吸收值，因此洗脫時如不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，OD260/OD280值會偏低，但并不表示純度低。6、DNA的儲存儲存溶液：DNA為兩性解離分子，在堿性條件下較穩(wěn)定，因此一般用TE（pH8.0）保存。TE的成分為：10mMTris-HCl（Tris與鹽酸形成強的緩沖對）；1mMEDTA（乙二胺四乙酸，能螯合二價金屬陽離子，YZDNase的活性）；pH8.0（堿性條件可減少DNA的脫氨作用，防止降解）。ddH2O的正常pH值為7.0，可作為DNA的儲存液，但有些實驗室制備的ddH2O呈酸性（pH值小于7.0），這不僅影響DNA的洗脫效率，而且導致長時間保存的DNA容易發(fā)生降解。因此建議用TE作為DNA的長期儲存液。儲存條件：為避免DNA降解，提取的DNA應先進行分裝，然后置于-20℃或-70℃保存，同時注意避免反復凍融造成DNA降解。[詳細]

  2024-09-29 11:52

  產品樣冊

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• 高通量組織研磨儀GT100實驗案例（快速提取DNA或RNA）

  高通量組織研磨儀GT100實驗案例（快速提取DNA或RNA）[詳細]

  2024-09-16 00:03

  應用文章

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  試驗室必備儀器[詳細]

  2012-06-27 00:00

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  實驗室必備常識[詳細]

  2014-03-24 00:00

  專利

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  解碼姥鯊基因組[詳細]

  2014-02-12 00:00

  標準

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• 血液基因組DNA提取試劑盒

  資料名稱：血液基因組DNA提取試劑盒 適用產品：使用本試劑盒回收的D N A 可適用于各種常規(guī)操作， 包括酶切、P C R 、文庫構建、Southern雜交等實驗。 正文語言：中文 文件編號：BP024-1 文件版本：1.0 文件格式：PDF 文件大小：0.9MB 內容簡介：本試劑盒采用酶裂解法裂解血液樣本，適用于從新鮮、加抗凝血劑或冷凍的血液樣本中提取基因組DNA。離心吸附柱采用的硅基質材料為本公司特有新型材料，可特異性、GX、專一吸附DNA，可Zda限度去除雜質蛋白及細胞中其他有機化合物。提取的基因組DNA片段大，純度高，質量穩(wěn)定可靠。[詳細]

  2018-05-23 09:43

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