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2018-10-12 10:00 3428閱讀次數(shù)

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• 酵母雙雜交的實(shí)驗(yàn)步驟和技巧分析

  LexA酵母雙雜交系統(tǒng)簡介一、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)的設(shè)計(jì)原理報(bào)告質(zhì)粒p8op-LacZ的GAL4UAS編碼序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活劑的情況下，報(bào)告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄活性為零，該基因的篩選標(biāo)志為URA3，可以作為有自主復(fù)制能力的質(zhì)粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因組DNA上。質(zhì)粒pLexA的篩選標(biāo)志為HIS3，在雙雜交系統(tǒng)中用于表達(dá)DNA-BD（202個(gè)氨基酸殘基組成的LexA蛋白）與目標(biāo)蛋白（釣餌，Bait）的融合蛋白，該融合體的表達(dá)受酵母強(qiáng)啟動(dòng)子ADH1的調(diào)控，選擇與報(bào)告基因的操縱子LexA×8結(jié)合。質(zhì)粒pB42AD的篩選標(biāo)志為TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)（EcoRI與XhoI）上游，含有SV40核定位（SV40nuclearlocalization）、HA（血凝素）及AD（來自于E.coli的88個(gè)氨基酸殘基組成的B42蛋白）等幾種編碼序列，共同組成可以啟動(dòng)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的激活成份。在酵母EGY48的基因組中還整合有另一個(gè)報(bào)告基因Leu，它與LacZ報(bào)告基因具有相同的操縱子-LexA，但兩者啟動(dòng)子不同。根據(jù)雙雜交系統(tǒng)的原理，如果某一復(fù)合物同時(shí)具有DNA-BD和AD的活性，即可激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。分別將待測蛋白X、Y的編碼序列插入pLexA質(zhì)粒載體和pB42AD質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)中，然后共同轉(zhuǎn)入含有報(bào)告基因的酵母菌株，如果蛋白X與Y能相互作用，則啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)情況，就可以間接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的強(qiáng)弱。如果將蛋白Y換為取自組織或血液的cDNA文庫，則可用X從該文庫中篩選出能與其相互作用的蛋白，并且可以獲得編碼這些蛋白的cDNA。二、商品化酵母雙雜交系統(tǒng)的組成1.載體質(zhì)粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文庫2.酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侶菌株）3.大腸桿菌菌株：E.coliKC8株4.對照質(zhì)粒：質(zhì)粒用途pLexA-53，pB42AD-T陽性對照pLexA-Pos（LexA/GAL4AD融合蛋白〕陽性對照pLexA-Lam（LaminC蛋白少與其它蛋白相互作用）假陽性檢測質(zhì)粒5.引物：pLexA測序引物及pB42AD測序引物。三、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的基本流程1.將報(bào)告基因p8op-LacZ轉(zhuǎn)化酵母EGY48菌株，用培養(yǎng)基SD/-Ura篩選。2.同時(shí)構(gòu)建或擴(kuò)增DNA文庫，并純化足夠的質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。3.構(gòu)建DNA-BD/靶蛋白質(zhì)粒pLexA-X，作為釣餌（bait）。4.將上述釣餌質(zhì)粒pLexA-X轉(zhuǎn)化EGY48（p8op-LacZ）細(xì)胞株，用SD/-His/-Ura篩選;并用固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Ura檢測此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活報(bào)告基因的活性，以及對酵母細(xì)胞是否具有殺傷毒性。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒選擇培養(yǎng)基克隆生長情況說明（含有Gal/Raf）pLexA-PosSD/-His，-Ura藍(lán)陽性對照pLexASD/-His，-Ura白陰性對照PlexA-XSD/-His，-Ura白沒有直接激活活性PlexA-XSD/-His，-Ura藍(lán)具有直接激活活性PlexA-XSD/-His，-Ura菌落不能生長酵母細(xì)胞毒性4-1.如果pLexA-X-半乳糖苷酶的信號作用。b能夠自動(dòng)激活報(bào)告基因，則設(shè)法去除其激活活性部位、或者將LacZ報(bào)告基因整合入基因組，減少4-2.如果pLexA-X雖然不會(huì)自動(dòng)激活報(bào)告基因，但對酵母宿主細(xì)胞有毒性，則需要與純化的文庫DNA同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母。5.如果pLexA-X既不會(huì)自動(dòng)激活報(bào)告基因，也不具有毒性，則可以與純化的文庫DNA同時(shí)、或順序轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，并檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒SD固體培養(yǎng)基LacZ表型對照1pLexA-PosGal/Raf/-His/-Ura藍(lán)對照2pLexA-53Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu藍(lán)+pB42AD-T實(shí)驗(yàn)pLexA-XGal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu待測+pB42AD-文庫5-1.用SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基選擇陽性共轉(zhuǎn)化子，并擴(kuò)增，使宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒在誘導(dǎo)前達(dá)到Zda拷貝數(shù)。-半乳糖苷酶無表達(dá)。b5-2.上述重組子轉(zhuǎn)至含X-gal的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，觀察LacZ及Leu報(bào)告基因的表達(dá)情形，藍(lán)色克隆即為陽性。白色克隆為假陽性，說明Leu雖有表達(dá)，但5-3.同時(shí)用LacZ、Leu兩個(gè)報(bào)告基因的目的，是為了盡可能消除實(shí)驗(yàn)的假陽性誤差，譬如：AD融合蛋白不與目標(biāo)蛋白結(jié)合，而直接與啟動(dòng)子序列結(jié)合域結(jié)合等情況。由于2個(gè)報(bào)告基因的啟動(dòng)子不同，出現(xiàn)上述假陽性的幾率就大大減少了。5-4.將藍(lán)色陽性克隆進(jìn)行1次以上的劃種，盡可能分離克隆中的多種文庫質(zhì)粒。6.陽性克隆的篩選6-1.隨機(jī)選取50個(gè)陽性克隆，擴(kuò)增、抽提酵母質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化E.coliKC8宿主菌，抽提大腸桿菌中的質(zhì)粒，酶切鑒定是否具有插入片段及排除相同的文庫質(zhì)粒。6-2.如果重復(fù)的插入序列較多，可另取50個(gè)陽性克隆來分析。Z后得到數(shù)種片段大小不同的插入序列，再轉(zhuǎn)化新的宿主細(xì)胞，檢測是否仍為陽性克隆。7.用質(zhì)粒自然分選法（NaturalSegregation）篩除只含有AD-文庫雜合子的克隆7-1.將初步得到的陽性克隆接種SD/-Trp/-Ura液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1-2天，含有HIS3編碼序列的BD-靶質(zhì)粒在含有外源His培養(yǎng)基中，將以10%-20%左右的頻率隨機(jī)丟失。C孵育2-3天。°7-2.將上述克隆，轉(zhuǎn)鋪固體培養(yǎng)基SD/-Trp/-Ura，307-3.再挑取生長的單克隆，轉(zhuǎn)入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基中，篩選His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文庫雜合子的重組子。7-4.將His表型缺陷的克隆轉(zhuǎn)化固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以驗(yàn)證AD-文庫能否直接激活報(bào)告基因的表達(dá)，棄去陽性克隆，保留陰性克隆。8.酵母雜合試驗(yàn)（YeastMating）確定真陽性克隆如下表所示，在酵母EGY48及其對應(yīng)的YM4271宿主細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入相應(yīng)的質(zhì)粒或文庫DNA，通過雜合實(shí)驗(yàn)確篩選pLexA-靶DNA與pB42AD-文庫確實(shí)具有相互作用的真陽性克隆。質(zhì)粒1（inYM4271）質(zhì)粒2（inEGY48）LacZ表型Leu表型pLexApB42AD白不能生長pLexA-靶DNApB42AD白不能生長pLexApB42AD-文庫白不能生長pLexA-靶DNApB42AD-文庫藍(lán)真陽性pLexA-LampB42AD-文庫白不能生長9.陽性克隆的進(jìn)一步篩選和確證9-1.擴(kuò)增初步確定的陽性克隆，抽提酵母DNA。該DNA為混合成份，既含有酵母基因組DNA，也含有3種轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。9-2.將上述DNA電轉(zhuǎn)化E.coliKC8宿主菌。由于在大腸桿菌中，具有不同復(fù)制起始調(diào)控序列的質(zhì)粒不相容;同時(shí)利用營養(yǎng)缺陷型篩選。因此，在M9/SD/-Trp培養(yǎng)基上，只有含有AD-文庫質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌才能生長，將其擴(kuò)增、并抽提質(zhì)粒DNA，酶切鑒定。9-3.用pLexA-靶DNA與pB42AD-庫DNA一一對應(yīng)、共轉(zhuǎn)化只含有報(bào)告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板擴(kuò)增，并與后面的誘導(dǎo)板形成對照，說明報(bào)告基因的表達(dá)與誘導(dǎo)AD融合蛋白的表達(dá)有關(guān)，再確證LacZ、Leu報(bào)告基因的表達(dá)。9-4.擴(kuò)增與靶DNA相互作用的文庫DNA，進(jìn)行序列分析及進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)、功能研究。10.對雙雜交系統(tǒng)陽性結(jié)果的進(jìn)一步研究10-1.用不同的雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證10-1-1.將載體pLexA與pB42AD互換后進(jìn)行雙雜交實(shí)驗(yàn)。10-1-2.選擇不同的雙雜交系統(tǒng)，如：以GAL4轉(zhuǎn)錄激活子為基礎(chǔ)的雙雜交系統(tǒng)。10-1-3.將文庫質(zhì)粒移碼突變后，再與靶質(zhì)粒作用，報(bào)告基因是否仍能被激活。-半乳糖苷酶水平，比較作用強(qiáng)度變化。b10-1-4.去除或突變特定結(jié)合位點(diǎn)，定量檢測10-2.用試劑盒提供的引物測定插入片段的DNA序列，證明其編碼區(qū)域。10-3.用其它的檢測方法，如：親和色譜法或免疫共沉淀法來證明雙雜交系統(tǒng)篩選的蛋白之間的具有相互作用。10-4.進(jìn)一步研究靶蛋白與篩選蛋白之間的功能關(guān)系構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫的擴(kuò)增1.自-80℃冰箱取出含有cDNA文庫的甘油菌，置于冰浴中緩慢化凍。2.用新鮮的LB培養(yǎng)液在1.5ml離心管中將上述甘油菌1:106和1:108稀釋。lml加入90m3.取稀釋菌液各1090mm）;37℃倒置培養(yǎng)過夜或30℃培養(yǎng)24-36hr，計(jì)數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。fLB培養(yǎng)液在1.5ml離心管中振蕩混勻，涂布LB/Amp平板（4.確定待擴(kuò)增的cDNA文庫滴度（cfu/ml）=克隆數(shù)×108（1:106稀釋）或克隆數(shù)×1010（1:108稀釋）。5.按照>150mm），共100塊;37℃倒置培養(yǎng)過夜。f2-4×104cfu/平板的濃度，涂布LB/Amp平板（6.在超凈工作臺(tái)上，在所有生長菌落的平板上加適量LB培養(yǎng)液，將菌落刮下，轉(zhuǎn)入2000mlLB/Amp培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)2-4hr。7.留取適量培養(yǎng)菌液以50%無菌甘油稀釋至25%終濃度，分裝，保存于-80℃。8.其余培養(yǎng)菌液離心8000xg×10min，4℃收集細(xì)菌;用質(zhì)粒DNA純化試劑盒大量抽提質(zhì)粒DNA。LB液體培養(yǎng)基，121℃，15lb/in2滅菌15minA.bacto-Tryptone10.0gB.bacto-YeastExtract5.0gC.NaCl10.0gD.ddH2O→1000ml*LB固體培養(yǎng)平板為含有1.5%瓊脂（Agar）LB培養(yǎng)基。**LB/Amp培養(yǎng)基為含有Ampg/ml的LB培養(yǎng)基。m50-100構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫的純化1.質(zhì)粒DNA提取緩沖液名稱緩沖液配方g/mlRNasemP1懸浮緩沖液50mMTris-HCl（pH8.0）;10mMEDTA;100AP2裂解緩沖液200mMNaOH;1%SDSP3中和緩沖液3.0MKac（pH5.5）QBT平衡緩沖液750mMNaCl;50mMMOPS（pH7.0）;15%異丙醇;0.15%TritonX-100QC洗滌緩沖液1.0MNaCl;50mMMOPS（pH7.0）;15%異丙醇QF洗脫緩沖液1.25MNaCl;50mMTris-HCl（pH8.5）;15%異丙醇2.培養(yǎng)菌液離心6000xg×10min，4℃，每500ml培養(yǎng)物（下同）的沉淀重懸于50mlP1緩沖液。3.加入50mlP2緩沖液，倒置4-6次混勻，室溫孵育5min。4.加入4℃預(yù)冷的50mlP3緩沖液，快速倒置4-6次混勻，冰浴30min（其間再倒置混勻4-6次）。5.將上述混合液再倒置混勻，離心12000xg×30min，4℃，保留上清。6.上清再離心12000xg×15min，4℃，留上清。7.將上清液上樣于經(jīng)35mlQBT緩沖液平衡的QIAGEN-tip層析柱。8.以100mlQC緩沖液洗滌層析柱2次。9.以35mlQF緩沖液洗脫吸附于層析柱上的DNA。10.以0.7倍體積異丙醇沉淀DNA，離心12500xg×30min，4℃，小心去除上清。11.以7ml70%乙醇洗滌沉淀DNA，離心12500xg×10min，4℃，小心去除上清。12.將沉淀的質(zhì)粒DNA溶于5mlTE（pH8.0）緩沖液，轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，用2.5倍體積無水乙醇;1/10體積3.0MNaAc（pH5.2），于-20℃靜置過夜。13.離心12500xg×20min，4℃，去除上清，沉淀用70%乙醇洗滌，超凈臺(tái)風(fēng)干。l），保存于-20℃。mg/管（用于1次轉(zhuǎn)化反應(yīng)，約40m14.干燥的DNA溶于適量體積TE，定量，分裝100-200構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞1.將酵母菌EGY48（p8op-lacZ）接種于5.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Trp5.0mlG.ddH2O→100.0ml2.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml3.室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。4.準(zhǔn)備下列試劑2×轉(zhuǎn)化反應(yīng)10×TE10×LiAc50%PEGddH2Olml/120ml15mA.1×TE/LiAc0.15ml15l/ml960ml120mB.PEG/LiAc1.20ml120lml//900mC.1×TE1.00ml1005.分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，振蕩混勻。lmg）3-5mA.pLexA-X（0.1B.10mg/mllmSpermDNA*（0.1mg）10*新配制時(shí)水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，振蕩混勻。m6.每管加入100lm7.各加入600PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。lm8.各加入70DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。9.室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清;以0.3ml1×TE重懸沉淀細(xì)胞，涂布SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen1.34gB.葡萄糖4.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）20.0mlD.20×Leu10.0mlE.20×Trp10.0mlF.Agar4.00gG.ddH2O90-100mm）f→200.0ml鋪8-10塊平板（附表1.不同規(guī)模轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞SmallScale*LargeScaleLibraryScale轉(zhuǎn)化反應(yīng)2011（1）SD液體培養(yǎng)基擴(kuò)增酵母菌100ml100ml300ml（2）YPD液體培養(yǎng)基擴(kuò)增酵母菌300mla300mla1000mla（3）TE或ddH2O洗滌酵母細(xì)胞15mlc25-50mlb500mla（4）準(zhǔn)備A.1×TE/LiAc緩沖液1.5mld1.0mld8.0mlcB.PEG/LiAc緩沖液12.0mlc6.0mlc100.0mlbC.1×TE緩沖液6.0mlc10.0mlc10.0mlc（5）分裝A.DNA-BDvectorgd×20/0.2-1.0mgcm0.1gd0.1-0.5mgmg×2010-50mB.ADvector0.1C.l2.0mlml×20200mSpermDNA（10mg/ml）101×TE/LiAc重懸感受態(tài)細(xì)胞1.5mlc1.0mlc8.0mlbl×201.0ml8.0mlm酵母感受態(tài)細(xì)胞100（7）PEG/LiAc緩沖液0.6ml×206.0ml60.0mll7.0mlml×20700mDMSO70（9）室溫離心后棄上清13000xg×10sec2000xg×5min2000xg×5min（10）1×TE重懸感受態(tài)細(xì)胞0.3ml×206.0ml10.0ml150mm×50f150mm×30f90mm×20f鋪固體選擇培養(yǎng)基平板注:*即為“構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞”**在不同容積的無菌離心管中進(jìn)行，a:300或500ml;b:50ml;c:15ml;d:1.5ml文庫cDNA轉(zhuǎn)化含有DNA-BD載體的酵母感受態(tài)細(xì)胞1.以生長于SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板上的含有構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA及報(bào)告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作為宿主菌，制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。2.將酵母宿主菌接種于5.0mlSD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0mlSD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×Leu5.0mlE.20×Trp5.0mlF.ddH2O→100.0ml3.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml4.室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。5.準(zhǔn)備下列試劑1×轉(zhuǎn)化反應(yīng)10×TE10×LiAc50%PEGddH2Olml/800ml100mA.1×TE/LiAc1.0ml100l4.8ml/ml600mB.PEG/LiAc6.0ml600C.1×TE10.0ml1.0ml//9.0ml6.取1.0ml用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入下列成份，振蕩混勻。lmg）40mA.pB42AD-Library（50-100B.10mg/mllmHerringDNA*（2.0mg）200*新配制時(shí)水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。7.加入6.0mlPEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。lm8.加入700DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。9.室溫離心2000xg×5min，盡量棄上清。10.以6.0ml100mm，每稀釋度各×2），30℃倒置培養(yǎng)3-5天，確定轉(zhuǎn)化效率在2×106cfu以上有效。fl稀釋不同倍數(shù)，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m1×TE重懸沉淀細(xì)胞，取10150mm×30），30℃倒置培養(yǎng)3-5天。fl涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m11.按每板200SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen13.40gB.葡萄糖40.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）200.0mlD.20×Leu100.0mlE.Agar40.00gF.ddH2O150mm）f→2000.0ml鋪30塊平板（12.在超凈工作臺(tái)上，在所有生長菌落的平板上各加5mlTE（pH7.0）緩沖液，將菌落刮下。13.離心棄上清，加入10-20mlTE緩沖液重懸沉淀菌，加入等體積的無菌65%甘油-MgSO4緩沖液，混勻，分裝1.0ml/管，保存于4℃1周或-80℃1年以上。65%甘油-MgSO4緩沖液:65%甘油;100mMMgSO4;25mMTris-HCl（pH8.0）A.甘油65.00mlB.MgSO47H2O2.465gC.2.0MTris-HCl（pH8.0）1.25mlD.ddH2O→100.00ml酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的篩選1.經(jīng)過選擇培養(yǎng)基篩選的含有DNA-BD載體、文庫DNA及報(bào)告基因的酵母感受態(tài)細(xì)胞，用無菌TE稀釋至1:104、1:106和1:108等不同濃度。90mm），30℃倒置培養(yǎng)3-5天，計(jì)數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。fl，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m2.取上述稀釋菌液各1003.確定待進(jìn)一步鑒定的酵母菌滴度（cfu/ml）=克隆數(shù)×105（1:104稀釋）、克隆數(shù)×107（1:106稀釋）或克隆數(shù)×109（1:108稀釋）。4.按照以前實(shí)驗(yàn)確定的文庫轉(zhuǎn)化效率的5-10倍的總量、0.5-2×106cfu/平板的菌量，涂布SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。5.挑取顯藍(lán)色的菌落，再接種于SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基以及SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以進(jìn)一步確證。SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基A.SD/Gal/Raf3.79gB.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlC.Agar2.00gD.ddH2O→85.0ml滅菌（115℃，10lb/in2）15min，冷卻至50℃，加入下列成份后鋪板E.10×BU10.0mlF.20mg/mlX-gal0.4ml90-100mm）f鋪5-6塊平板（10×BU緩沖液，121℃，15lb/in2滅菌15minA.Na2HPO412H2O9.30gB.NaH2PO42H2O3.90gC.ddH2O→100.0ml20mg/mlX-GalA.X-Gal40mgB.DMF2ml酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的鑒定-酵母質(zhì)粒DNA的提取1.挑取經(jīng)過酵母選擇/誘導(dǎo)培養(yǎng)基初步鑒定的酵母單菌落，接種于5.0-10.0mlSD/-Trp液體培養(yǎng)基，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)20hr。SD/-Trp液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Ura5.0mlG.ddH2O→100.0ml2.室溫離心5000xg×1min，棄上清，收菌。l酵母裂解液，振蕩重懸沉淀酵母菌。m3.加入200酵母裂解液:2%TritonX-100;1%SDS;100mMNaCl;10mMTris-HCl（pH8.0）;1mMEDTAA.10%TritonX-10020.0mlB.10%SDS10.0mlC.NaCl0.58gD.Tris0.12gE.EDTANa22H2O0.04gF.1.0MHCl調(diào)pH8.0G.ddH2O→100.0ml4.加入下列試劑，充分振蕩5min;液氮凍存10min，室溫復(fù)融;再充分振蕩5min。A.經(jīng)酸處理的玻璃珠（Sigma）0.20gB.苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）0.2ml5.室溫離心12000xg×10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入下列試劑，于-70℃凍存30-60min。A.3MNaAc（1/10lmV）20lmB.無水乙醇（2.5V）5006.離心12500xg×10min，4℃，棄上清;70%乙醇洗滌沉淀，于37℃烘箱或超凈臺(tái)干燥DNA;將干燥的沉淀DNA重溶于l無菌ddH2O中，保存于-20℃。m20-30酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的鑒定-酵母質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化大腸桿菌1.在冰浴條件下，取待轉(zhuǎn)化DNAl感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。mg），加入100ml（5pg-0.5m1.0WF，200m2.將上述混合液加入間距0.1cm的樣品杯中，電轉(zhuǎn)化（1.8kV，25。3.迅速加入1ml新鮮的LB培養(yǎng)液，混勻，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，37℃恒溫，150rpm振蕩孵育30-60min。4.將上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布M9/DO（-Trp）固體培養(yǎng)板，37℃倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)（16-22hr）。5.按常規(guī)方法擴(kuò)增上述陽性轉(zhuǎn)化菌，堿裂解法少量抽提質(zhì)粒DNA，酶切篩選AD載體上含有插入片段的陽性克隆，保存其于25%甘油，待進(jìn)一步驗(yàn)證。M9/DO-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.葡萄糖1.2gB.Agar6.0gC.5×M9緩沖液60mlD.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）30mlE.20×His15mlF.20×Leu15mlG.20×Ura15mlH.ddH2O165ml冷卻至50℃左右，加入下列成份，混勻鋪板I.1.0MThiamine-HCl（Vit.B1）0.3mlJ.100mg/mlAmp0.3ml90-100mm）f鋪10-15塊平板（大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（電轉(zhuǎn)化）1.挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的E.coliKC8單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜（約12-14hr）。2.將2.5ml新鮮菌液接種于500mlSOB培養(yǎng)液中，37℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5-0.6（約2.5-3hr）。SOB液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.bacto-Tryptone10.00gB.bacto-YeastExtract2.50gC.NaCl0.25gD.KCl0.09gE.MgCl26H2O1.02gF.ddH2O→500.0ml3.將培養(yǎng)菌液收集于離心管中，冰水浴15-20min。4.離心6000xg×10min，4℃，棄盡上清;以5ml預(yù)冷的無菌ddH2O重懸沉淀菌;再加入500ml預(yù)冷的無菌ddH2O洗滌細(xì)菌。5.重復(fù)上述步驟1次，以充分去除培養(yǎng)基中殘余的鹽離子成份。6.用40-50ml預(yù)冷的無菌10%甘油重懸沉淀細(xì)菌，轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管中;離心6000xg×10min，4℃，棄盡上清;重復(fù)此步驟1次。7.以等體積（約1.5-2.0ml）預(yù)冷的無菌10%甘油重懸上述沉淀的感受態(tài)細(xì)胞，分裝0.5ml/管（5-6次轉(zhuǎn)化反應(yīng)），保存于-80℃?zhèn)溆?。酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的確證1.以含有報(bào)告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作為轉(zhuǎn)化宿主菌。2.將酵母宿主菌接種于5.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Trp5.0mlG.ddH2O→100.0ml3.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml4.室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。5.準(zhǔn)備下列試劑20×轉(zhuǎn)化反應(yīng)10×TE10×LiAc50%PEGddH2Ol/1.2mlml150mA.1×TE/LiAc1.5ml150B.PEG/LiAc12.0ml1.2ml1.2ml9.6ml/C.1×TE10.0ml1.0ml//9.0ml6.分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。A.pLexAlmg）3-5morpLexA-X（0.1lmg）3-5mB.pB42AD-Y（0.1C.10mg/mlSpermlmDNA*（0.1mg）10*新配制時(shí)水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，振蕩混勻。m7.每管加入100lm8.各加入600PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。lm9.各加入70DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。10.室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清;以0.3ml1×TE重懸沉淀細(xì)胞，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen3.35gB.葡萄糖10.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）50.0mlD.20×Leu25.0mlE.Agar10.00gF.ddH2O→500.0ml90-100mm）f鋪20-25塊平板（11.挑取上述固體培養(yǎng)基上生長的含有目的DNA（X）的pLexA-X（+）或空載pLexA（-）單菌落，分別接種SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基A.SD/Gal/Raf3.79gB.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlC.Agar2.00gD.ddH2O→85.0ml滅菌（115℃，10lb/in2）15min，冷卻至50℃，加入下列成份后鋪板E.10×BU10.0mlF.20mg/mlX-gal0.4ml90-100mm）f鋪5-6塊平板（12.選擇含有pLexA-X顯藍(lán)色，而相應(yīng)的不含有插入DNA的空載pLexA顯白色的克隆，擴(kuò)增其在E.coliKC8中的甘油菌，按常規(guī)抽提質(zhì)粒DNA，進(jìn)行序列分析。10×DO（-His，-Trp，-Leu，-Ura）為不含His，Trp，Leu，Ura等成份的10×Dropout溶液。每1000ml溶液中含有下列成份，用ddH2O配制后保存于4℃。（1）L-IsoleucineL-異亮氨酸300mg（2）L-ValineL-纈氨酸1500mg（3）Adenine腺嘌呤200mg（4）L-ArginineHClL-精氨酸200mg（5）L-LysineHClL-賴氨酸鹽酸鹽300mgL-MethionineL-甲硫氨酸200mg（7）L-PhenylalanineL-苯丙氨酸500mgL-ThreonineL-蘇氨酸2000mg（9）L-TyrosineL-酪氨酸300mg20×氨基酸儲(chǔ)存液每100ml溶液中分別含有下列成份，配制后保存于4℃。20×HisL-HistidineL-組氨酸40mg20×TrpL-TryptophanL-色氨酸40mg20×LeuL-LeucineL-白氨酸200mg20×UraUracil尿嘧啶40mg酵母轉(zhuǎn)化緩沖液:緩沖液體積緩沖液配制10×TE100mlTris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O80ml;鹽酸調(diào)pH7.5;ddH2O定容10×LiAc100mlLiAc2H2O10.20g;ddH2O50ml，冰醋酸調(diào)pH7.5;ddH2O定容50%PEG100mlPEG335050.0g;ddH2O定容其它緩沖液:緩沖液體積緩沖液配制TE1000mlTris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O800ml;鹽酸調(diào)pH;ddH2O定容STE1000mlNaCl5.84g;Tris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O800ml;鹽酸調(diào)pH8.0;ddH2O定容[詳細(xì)]

  2018-10-12 10:00

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  2015-04-01 00:00

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  2009-03-28 00:00

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  上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司專業(yè)供應(yīng)各種屬elisa試劑盒，提供免費(fèi)代測服務(wù)，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果客觀真實(shí)性。我公司對試劑盒質(zhì)量1**%保證，若存在質(zhì)量問題，我們無條件包退換。若需要了解試劑盒的詳細(xì)信息，請來的咨詢：電話：021-6052049813636351217業(yè)務(wù)QQ:1005074258何經(jīng)理ELISA實(shí)驗(yàn)原理、步驟、ELISA問題分析ELISA實(shí)驗(yàn)原理酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）原理1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度類型及步驟ELISA的主要常用類型及步驟1.間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（二抗）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。2）加稀釋的樣本，保溫反應(yīng)。樣本中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，樣本中的其他成份在洗滌過程中被洗去。3）加酶標(biāo)抗抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗抗體結(jié)合，從而間接記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與樣本中受檢抗體的量正相關(guān)。4）加底物顯色。2.雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法是檢測抗原Z常用的方法，操作步驟如下：1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2）加受檢樣本，保溫反應(yīng)。樣本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與樣本中受檢抗原的量相關(guān)。4）加底物顯色。3.雙抗原夾心法測抗體反應(yīng)原理和模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體4.競爭法測抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，Z后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。ELISAQ&A如何選擇合適的陽性對照?陽性對照的基本組成應(yīng)該盡量與檢測樣本的組成一致，一般陽性對照多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，加入一定量的待檢物質(zhì)。比如，以人血清為標(biāo)本的測定，陽性對照多用確定的病人血清或者以復(fù)鈣人血漿為原料加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品。如何選擇合適的陰性對照?陰性對照的基本組成也應(yīng)該盡量與檢測樣本的組成一致，**先行檢測確定其中不含待檢物質(zhì)。比如，檢測人血清標(biāo)本時(shí)，陰性對照應(yīng)該選擇正常人血清;檢測免疫動(dòng)物血清中抗體效價(jià)時(shí)，陰性對照應(yīng)該選擇該動(dòng)物的免疫前血清。如何選擇Zyou化的包被條件?1.包被抗原的選擇包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類。天然蛋白需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被，對于含雜質(zhì)較多的抗原可以采用間接捕獲法包被（先用能夠與目的抗原反應(yīng)的物質(zhì)如抗體直接吸附在酶標(biāo)板上，再通過特異性反應(yīng)使抗原固相化）。經(jīng)純化的重組蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機(jī)化合物，由于分子量太小，往往難于直接吸附在酶標(biāo)板上，一般都先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如BSA等偶聯(lián)，偶聯(lián)物吸附于固相載體上。2.包被液的選擇一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液，如果包被的抗原在堿性條件下不穩(wěn)定的話，也可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液。3.包被溫度的選擇通常是4-8度條件下過夜或者37度保溫2小時(shí)，我們強(qiáng)烈建議4-8度條件下包被，有利于蛋白活性的保持。4.包被濃度的選擇包被的Z適濃度隨固相載體和包被物的性質(zhì)變化，一般蛋白質(zhì)的包被濃度為1-5ug/ml，要明確針對特定包被抗原的Z適包被濃度需要通過實(shí)驗(yàn)來確定。包板后需要封閉嗎?應(yīng)該選擇什么樣的封閉體系?封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。而在間接法測定中，封閉一般是必不可少的。常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉，AbMART推薦使用5%脫脂奶粉，價(jià)廉而且封閉能力強(qiáng)，不過5%脫脂奶粉只適合短期內(nèi)使用，不宜長期保存，所以試劑盒中較少使用。如何正確使用酶結(jié)合物?1.酶結(jié)合物的稀釋液在稀釋液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%BSA或5%脫脂奶粉），通過競爭YZ酶結(jié)合物在固相載體上的非特異性吸附。一般還加入能夠YZ蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20（0.05%的濃度較為適宜）。2.正確稀釋酶結(jié)合物酶結(jié)合物的合適工作濃度需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定，濃度過高易導(dǎo)致本底偏高，濃度過低則會(huì)導(dǎo)致陽性信號的減弱。酶結(jié)合物**在使用前稀釋，稀釋后的酶結(jié)合物不宜長期保存，因?yàn)榈蜐舛鹊拿附Y(jié)合物極易失活。問題可能的原因解決方法陰性對照產(chǎn)生了陽性的結(jié)果試劑或者耗材污染更換試劑，使用一次性耗材洗板出現(xiàn)問題更換更強(qiáng)配方的洗滌液，增加洗板次數(shù)，延長洗板時(shí)間如果是在雙抗體夾心法中出現(xiàn)，有可能是包被抗體與二抗間有交叉反應(yīng)更換包被抗體或二抗使用了過多的抗體減少抗體使用量整板出現(xiàn)高背景二抗產(chǎn)生了非特異性吸附減少二抗使用量，縮短二抗反應(yīng)時(shí)間顯色液不新鮮使用現(xiàn)配的顯色液顯色反應(yīng)時(shí)間過長沒有終止控制顯色反應(yīng)時(shí)間，及時(shí)終止反應(yīng)試劑或者耗材污染更換試劑，使用一次性耗材反應(yīng)溫度過高導(dǎo)致的非特異性吸附嚴(yán)格控制反應(yīng)在Z適溫度下進(jìn)行封閉條件不佳導(dǎo)致的非特異性吸附更換封閉能力更強(qiáng)的封閉液，延長封閉時(shí)間反應(yīng)信號偏低包被條件不合適提高包板濃度，延長包板時(shí)間抗原抗體反應(yīng)不夠充分延長反應(yīng)時(shí)間，確保反應(yīng)在Z適溫度下進(jìn)行顯色液配方不恰當(dāng)增加顯色底物的量二抗結(jié)合不夠提高二抗?jié)舛?，延長反應(yīng)時(shí)間，更換效果更好的二抗梯度稀釋做ELISA時(shí)產(chǎn)生跳孔現(xiàn)象酶標(biāo)板疊放導(dǎo)致傳熱不均勻，各孔反應(yīng)溫度有差異盡量避免酶標(biāo)板疊放在一起移液器稀釋時(shí)未能保持連續(xù)性定期校準(zhǔn)移液器，確保移液器的正確使用反應(yīng)溶液蒸發(fā)酶標(biāo)板用封條密封或者加蓋洗板不均勻確定洗板機(jī)能夠正常工作酶標(biāo)板底有雜物或者水珠讀板時(shí)清理干凈酶標(biāo)板底部[詳細(xì)]

  2018-11-16 10:02

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  2016-05-03 00:00

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  2007-11-07 00:00

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  2024-09-20 00:04

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  2014-07-11 00:00

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  Normal07.8磅02falsefalsefalseMicrosoftInternetExplorer4黃曲霉毒素B1的實(shí)驗(yàn)步驟、自備物品微孔板酶標(biāo)儀（含450nm）、振蕩器、粉碎機(jī)、微量移液器、量筒、漏斗、容量瓶、快速定性濾紙、氯化鈉（分析純）、甲醇（分析純）、去離子水或蒸餾水。樣品處理取5g粉碎的有代表性的樣品，加1.25g氯化捺及250mL70%甲醇溶液，QL振蕩3min，用快速定性濾紙過濾。取50μL稀釋液進(jìn)行分析。根據(jù)需要可以增加樣品量，但甲醇溶液的量也應(yīng)相應(yīng)增加。實(shí)驗(yàn)步驟1試劑盒平衡至室溫。取所需數(shù)量的板條插入微孔架，記錄樣品及標(biāo)準(zhǔn)的位置。2加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到微孔，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭。3加入50μL抗AFB1單克隆抗體使用液到每個(gè)微孔，37℃避光孵育90min。4甩掉空中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，Z后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以完全除去孔中液體。5每孔加入酶標(biāo)物100μL，37℃避光孵育60min。6用洗液洗滌微孔板3min×3次，Z后一次應(yīng)在吸水紙上拍打已完全除去孔液體。7沒空加入顯色液100μL（2滴），37℃避光孵育10min。8每孔加入終止液50μL（1滴），立即用酶標(biāo)儀在波長450nm處測定吸光度值（OD）值。測定1目測法：未加終止液前目測。比較樣品孔與標(biāo)準(zhǔn)1的微孔顏色，若淺，則為陽性；若深，則為陰性；顏色接近則需用酶標(biāo)儀測吸光度值比較。2儀器法：用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值。[詳細(xì)]

  2018-11-15 10:03

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  汽油熱值測定儀試驗(yàn)步驟 1、準(zhǔn)備內(nèi)筒水： 適當(dāng)調(diào)節(jié)小筒水溫，一般要使小筒水溫低于外筒溫度1K左右，這樣才能到試驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)內(nèi)筒比外筒高1K左右，作標(biāo)定或測發(fā)熱量做平行樣時(shí)。 2、準(zhǔn)備氧彈 將饒制好的點(diǎn)火絲緊固在氧彈的兩個(gè)點(diǎn)火電極上，確保接觸良好,點(diǎn)火絲的阻值一般取4～6Ω。 3、將小筒小心放入套筒中,把氧彈平穩(wěn)放入小筒的支腳上，輕輕合上上蓋，使上蓋上的ZX電極與氧彈彈頭良好接觸，否則可通過調(diào)節(jié)ZX電極螺釘露出長度來實(shí)現(xiàn)。調(diào)節(jié)好后，上蓋壓下時(shí)密封圈圓周與方箱上面應(yīng)均勻接觸。 4、選擇試驗(yàn)的項(xiàng)目（標(biāo)定或測量），輸入試樣數(shù)據(jù)，開始進(jìn)行試驗(yàn)。整個(gè)試驗(yàn)過程參見上述相關(guān)內(nèi)容。 5、試驗(yàn)結(jié)束，屏幕顯示試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)打印選項(xiàng)設(shè)為“自動(dòng)”時(shí)，還將自動(dòng)打印輸出試驗(yàn)報(bào)告。 6、掀起上蓋，取出小筒和氧彈將氧彈放氣后打開進(jìn)行清洗，為下一次試驗(yàn)作準(zhǔn)備。[詳細(xì)]

  2020-06-09 19:47

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  酶聯(lián)免疫法實(shí)驗(yàn)步驟[詳細(xì)]

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  利用具有3’-5’外切酶活性的高保真DNa聚合酶，如Pfu等進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其PCR產(chǎn)物為不帶A尾的平末端DNa片段，如想將該片段克隆到T載體上，需要先利用A-Tai領(lǐng)Enzyme在平末端片段后加上A尾后才能與T載體上3’末端的T堿基互補(bǔ)連接。本產(chǎn)品是在平末端DNa片段的3’末端添加一個(gè)A尾，使平末端的DNa片段進(jìn)行TA克隆成為可能。本試劑盒提供了加A尾需要的所有成分，可以在30分鐘完成整個(gè)過程。與平末端DNa片段克隆相比，TA克隆具有較高的克隆效率，可大大提高實(shí)驗(yàn)成功率。[詳細(xì)]

  2018-09-04 10:00

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  1 準(zhǔn)備工作 1.1 將稀鹽酸（1：4）注入所用的瓷坩堝（或瓷蒸發(fā)皿）內(nèi)煮沸幾分鐘，用蒸餾水洗滌。烘干后放在高溫爐中在775±25℃溫度下煅燒至少10分鐘，取出在空氣中冷卻3分鐘，移入干燥器中。冷卻至室溫后注，進(jìn)行稱量，稱準(zhǔn)至0.0001克。 重復(fù)進(jìn)行煅燒、冷卻及稱量，直至連續(xù)兩次稱量間的差數(shù)不大于0.0005克為止。 注：一個(gè)干燥器中放一對坩堝為宜。放一對50毫升的坩堝，一般冷卻30~45分鐘可達(dá)到室溫；放一對100毫升的坩堝，一般冷卻45分鐘到1小時(shí)可達(dá)到室溫。坩堝一以冷卻就應(yīng)進(jìn)行稱量，坩堝在干燥器內(nèi)停留多長時(shí)間，則其后的所有稱量都應(yīng)當(dāng)讓其在干燥器內(nèi)停留同樣長的時(shí)間以后才進(jìn)行。 1.2 取樣前將瓶中試樣（其量不得多于該瓶容積的3/4）劇烈搖動(dòng)均勻，要確保所取試樣有真正的代表性。對粘稠的或含蠟的試樣需預(yù)先加熱至50～60℃。再搖動(dòng)均勻后進(jìn)行取樣。 2實(shí)驗(yàn)步驟 2.1 將已經(jīng)恒重的坩堝稱量準(zhǔn)確至0.1g，并以同樣的準(zhǔn)確度稱入試樣。根據(jù)情況，一般可取25g試樣裝在50ml得坩堝內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。所取試樣量的多少依試樣灰分含量的大小而定，以所取試樣能足以生成20mg的灰分為限，但[詳細(xì)]

  2024-09-12 17:12

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  做實(shí)驗(yàn)時(shí)馬弗爐使用技巧[詳細(xì)]

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