自發(fā)熒光（AF）干擾給流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)帶來(lái)巨大的困擾，使熒光信號(hào)的檢測(cè)、定量和解釋更加復(fù)雜。同時(shí)，異質(zhì)性的自發(fā)熒光在不同細(xì)胞類型和成分之間變化，使結(jié)果分析復(fù)雜性增加。

雖然AF有助于評(píng)估細(xì)胞狀態(tài)，但其光譜干擾（尤其在400-600 nm區(qū)間）會(huì)掩蓋弱信號(hào)標(biāo)記物（如FITC/Alexa Fluor 488），導(dǎo)致：

如圖1所示，在未染色的植物提取物中檢測(cè)到升高的自發(fā)熒光（AF）水平，提示后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析可能存在潛在的復(fù)雜性。實(shí)驗(yàn)程序和染色技術(shù)，如醛固定和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，也會(huì)影響細(xì)胞的自發(fā)熒光水平，從而增加細(xì)胞分析中自發(fā)熒光的復(fù)雜性和變異性。

光譜流式細(xì)胞術(shù)通過捕捉每種熒光分子在廣泛波長(zhǎng)范圍內(nèi)的整個(gè)發(fā)射光譜，為其生成唯一的光譜特征，隨后用于特定光譜解混和識(shí)別。然而，光譜流式通過全光譜捕獲實(shí)現(xiàn)多色解混，但AF仍帶來(lái)三大挑戰(zhàn)（圖2）：

如何應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)和難題，需要全面了解樣本、精心設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、嚴(yán)格的去混合技術(shù)以及適當(dāng)?shù)膶?duì)照，以提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。同時(shí)，使用多個(gè)通道區(qū)分自發(fā)熒光信號(hào)和特定的熒光染料至關(guān)重要，因此我們需要一臺(tái)功能更全面的科研利器的助力。

近期上市的??CytoFLEX mosaic光譜流式分析儀可提供10個(gè)未染色通道，可從中提取不同群體的自發(fā)熒光特征，提升弱信號(hào)的檢測(cè)能力，幫助發(fā)現(xiàn)低豐度亞群。

下圖顯示了在CytoFLEX mosaic光譜流式分析儀上評(píng)估了AF提取對(duì)白細(xì)胞群體譜解混的影響，并評(píng)估了使用多個(gè)AF特征是否進(jìn)一步改善了解混。

針對(duì)不同細(xì)胞群體（中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）表面標(biāo)志物表達(dá)的直方圖，在同一文件中考慮了0、1、2或4個(gè)自發(fā)熒光簽名在解混矩陣中的影響。紅色（No AF）表示沒有進(jìn)行自發(fā)熒光提取的數(shù)據(jù)，藍(lán)色（1 AF）表示去除一個(gè)自發(fā)熒光簽名后的數(shù)據(jù)，橙色（2 AF）表示去除兩個(gè)自發(fā)熒光簽名后的數(shù)據(jù)，綠色（4 AF）表示去除四個(gè)自發(fā)熒光簽名后的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，通過優(yōu)化AF校正，減少了嗜酸細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中假陽(yáng)性CD16的情況，同時(shí)保留了真實(shí)的生物信號(hào)。

CytoFLEX mosaic還提供了光譜拆分后的結(jié)果驗(yàn)證功能，實(shí)時(shí)評(píng)估解析準(zhǔn)確性。當(dāng)數(shù)據(jù)出現(xiàn)異常時(shí)，儀器能自動(dòng)提示潛在問題通道，讓研究人員輕松快速地排除數(shù)據(jù)隱患，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。最后，光譜分析軟件CytExpert for Spectral，延續(xù)了CytExpert軟件智能易操作的特點(diǎn)，非常容易學(xué)習(xí)和操作。