眾所周知，流式細(xì)胞分選技術(shù)是利用流式細(xì)胞分選儀，以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度。下面就讓小編帶你簡(jiǎn)單了解一下流式樣品制備中的注意事項(xiàng)。

一、熒光素和抗體的選擇

1)熒光素的選擇

如今，國(guó)內(nèi)很多引進(jìn)的流式細(xì)胞儀只裝了一個(gè)激光光源，就是488nm光源，因此我們需要選擇可以被488nm激光激發(fā)的熒光素。例如：

檢測(cè)細(xì)胞DNA與RNA含量：PI、7-AAD。

檢測(cè)細(xì)胞蛋白、抗體或者抗原：FITC、PE、Per-CP、PE-CY5、PerCP-CY5.5。

檢測(cè)細(xì)胞膜電位：Rho-123。

檢測(cè)Ca2+:Fluo-3.

2)抗體的選擇

必須選擇流式用單克隆抗體，這一類抗體在制備的過(guò)程中質(zhì)控非常嚴(yán)格。

二、樣品的準(zhǔn)備

有三個(gè)評(píng)價(jià)樣品制備優(yōu)劣的指標(biāo)：

1）細(xì)胞的密度，細(xì)胞的密度不能小于1*10的六次方/ml。

2）非特異熒光，不超過(guò)百分之一。

3）細(xì)胞的碎片或者聚集體，不能出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的團(tuán)塊。

流式樣品制備過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題和方法

問(wèn)題：細(xì)胞密度低

原因：制備過(guò)程中細(xì)胞損失

方法：增加離心時(shí)間、吸棄上清。

問(wèn)題：非特異熒光強(qiáng)

原因：抗體不純，死亡細(xì)胞多

方法：選擇高純度的抗體，用同型對(duì)照抗體或雙標(biāo)記排除非特異熒光。

問(wèn)題：碎片多

原因：細(xì)胞死亡，機(jī)械損傷

方法：在細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)檢測(cè)，防止反復(fù)吹打。

問(wèn)題：細(xì)胞聚集

原因：消化不完全，酒精固定造成的細(xì)胞粘連

方法：徹底消化、在用酒精固定細(xì)胞時(shí)加入終濃度為百分之1.5-3的小牛血清。

問(wèn)題：熒光弱

原因：靈敏度不夠，抗體加入量不飽和，反應(yīng)時(shí)間少

方法：改用生物素-親和素，增加抗體的用量，延長(zhǎng)反應(yīng)的時(shí)間

問(wèn)題:檢測(cè)不出二倍體峰

原因：凋亡測(cè)試的方法不對(duì)

方法：改用原位末端標(biāo)記或者PI與Annexin-V雙標(biāo)記法