流式細(xì)胞儀（Flow cytometer ）是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的裝置。它可以快速測(cè)量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細(xì)胞亞群從中分選出來。下面就讓小編帶你了解一下流式細(xì)胞儀具體的實(shí)驗(yàn)操作。

PI染色操作步驟

1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm,5min，棄上清液。

2、加入PBS1ml離心洗滌1次，棄上清。

3、加入2ml預(yù)冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定過夜。

4、離心，棄上清液。

5、用1×PBS1ml洗滌1次，離心。

6、加入RNaseA(工作濃度20ug/ml)于500ul1×PBS中，37℃孵育30min，離心。

7、用1×PBS1ml洗滌1次，離心。

8、加入PI(工作濃度50ug/ml)于500ul1×PBS中，室溫避光孵育30min。

9、混勻，過300目篩網(wǎng)，置流式管中，4℃冰箱保存，待測(cè)。

GFPPI染色操作步驟

1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm,5min，棄上清液。

2、加入PBS1ml離心洗滌1次，棄上清。

3、加入2ml預(yù)冷PFA，PFA的濃度根據(jù)細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)，4℃固定30min。

4、離心，棄上清液。

5、用1×PBS1ml洗滌1次，離心。

6、加入RNaseA(工作濃度20ug/ml)于500ul1×PBS中，37℃孵育30min，離心。

7、用1×PBS1ml洗滌1次，離心。

8、加入PI(工作濃度50ug/ml)于500ul1×PBS中，室溫避光孵育30min。

9、混勻，過300目篩網(wǎng)，置流式管中，4℃冰箱保存，待測(cè)。

細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟

1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm,5min，棄上清液。

2、以冷PBA 1ml，離心洗滌，棄上清液。

3、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul。用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min-1h。

4、離心棄上清液。

5、加入冷PBS 1ml,離心洗滌2次，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。

6、向細(xì)胞中加入冷PBS500ul,吹打混勻，置流式管中，4℃避光保存，待測(cè)。

細(xì)胞表面間接免疫熒光染色操作步驟

1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm,5min，棄上清液。

2、以冷PBA 1ml，離心洗滌，棄上清液。

3、用PBA稀釋的diyi抗體200ul，對(duì)照管加入對(duì)應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IgG，輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育1.5-2h。離心，棄上清。

4、PBS 1ml離心洗滌1次，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。

5、PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200ul。吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min，避光。

6、PBS 1ml離心洗滌2次。

7、將細(xì)胞重新懸浮于500ulPBS中，混勻，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待測(cè)。

胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟

1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm,5min，棄上清液。

2、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。

3、4%PFA 1ml，4℃固定30min。

4、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。

5、0、1%Triton-1001ml,室溫10min。

6、用1×PBS1ml洗滌1次，離心。

7、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul，用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min-1h。

8、離心棄上清液。

9、加入冷PBS 1ml,離心洗滌2次，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。

10、向細(xì)胞中加入冷PBS500ul,吹打混勻，置流式管中，4℃避光保存，待測(cè)。

胞內(nèi)間接免疫熒光染色操作步驟

1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm,5min，棄上清液。

2、用1×PBS1ml洗滌1次，離心。

3、4%PFA1ml，4℃固定30min。

4、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。

5、0.1%Triton-1001ml,室溫10min。

6、用1×PBS1ml洗滌1次，離心。

7、加入用PBA稀釋的diyi抗體200ul，對(duì)照管加入對(duì)應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IgG，輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育1.5-2h。離心，棄上清。

8、冷PBS 1ml離心洗滌1次，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。

9、加入PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200ul。吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min，避光。

10、冷PBA 1ml離心洗滌2次。

11、將細(xì)胞重新懸浮于500ul PBS中，混勻，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待測(cè)。

注：

1、RNaseA：貯液濃度：1mg/ml；

工作液配制：加1mg/ml貯液10ul于500ul×PBS中，使終濃度為20ug/ml。

2、PI：貯液濃度：2.5mg/ml

工作液配制：加2.5mg/ml貯液10ul于500ul×PBS中，使終濃度為50ug/ml。

3、PBA：即PBS加1-2%牛血清白蛋白，加0.1%疊氮鈉。

4、檢測(cè)樣品細(xì)胞濃度1x10的六次方/ml。