當(dāng)前，臨床流式細(xì)胞分析已成為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個(gè)熱點(diǎn)，其發(fā)展趨勢(shì)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

一．從相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)到細(xì)胞計(jì)數(shù)

流式細(xì)胞分析Zda的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)混合細(xì)胞群體中亞群細(xì)胞的計(jì)數(shù)，如淋巴細(xì)胞可依其表面標(biāo)志的不同分為T淋巴細(xì)胞（CD3+）、B淋巴細(xì)胞（CD19+）、NK細(xì)胞（CD16+56+/CD3-），T淋巴細(xì)胞又可進(jìn)一步分為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4+CD8-）和YZ/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4-CD8+）等。這些亞群細(xì)胞計(jì)數(shù)過去多以相對(duì)百分比表達(dá)結(jié)果，由于百分比只能代表每種細(xì)胞在混合細(xì)胞群體中所占的比例，并不能體現(xiàn)其在單位體積血液中的數(shù)量，而對(duì)艾滋病等一些疾病的臨床診斷，有時(shí)需要考慮細(xì)胞的數(shù)量，如患者血液中T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+CD8-）的數(shù)量<200個(gè)/μL，而未發(fā)病（僅有HIV感染）者的數(shù)量>200個(gè)/μL。T淋巴細(xì)胞亞群的計(jì)數(shù)在國(guó)外實(shí)驗(yàn)室早已成為常規(guī)檢查，但在國(guó)內(nèi)僅有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室開展。可以預(yù)見，隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，對(duì)造血干細(xì)胞等的數(shù)量分析，不久的將來，也將作為常規(guī)檢查項(xiàng)目，走出實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入臨床。

流式細(xì)胞計(jì)數(shù)在臨床可開展的項(xiàng)目包括：①淋巴細(xì)胞亞群，尤其是T淋巴細(xì)胞亞群的計(jì)數(shù)。②外周血或骨sui中造血干/祖細(xì)胞的計(jì)數(shù)。③血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞的計(jì)數(shù)。④血液中血小板數(shù)量，尤其是血小板減少癥患者血小板的計(jì)數(shù)，此種計(jì)數(shù)優(yōu)于血細(xì)胞分析儀法，已成為血小板計(jì)數(shù)的國(guó)際推薦參考方法。此外，可能出現(xiàn)在血液中的其它一些稀少細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞、轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞等）的計(jì)數(shù)，也將發(fā)展為流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)的開展對(duì)臨床疾病的診斷、ZL等有重要意義。

二．從相對(duì)定量到定量分析

細(xì)胞的多種成分如某些抗原或受體表達(dá)的流式細(xì)胞分析，以前多以平均熒光強(qiáng)度（MFI）或相對(duì)熒光強(qiáng)度（RFI）表達(dá)其含量。由于流式細(xì)胞儀每次的儀器狀況可出現(xiàn)差異，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室所用儀器的類型也不盡相同，因此，以MFI或RFI表示細(xì)胞抗原或受體的表達(dá)量缺乏可比性，雖然流式細(xì)胞儀有極高的熒光靈敏度，但卻無法準(zhǔn)確應(yīng)用這些信息。近年來，為了通過FCM精確定量分析細(xì)胞的某些成分，定量流式細(xì)胞術(shù)（Quantitative Flow Cytometry，QFCM）逐漸得到發(fā)展，其定量分析原理主要有兩種：①定量抗體微球法：在特制的微球上包被已知分子數(shù)的羊抗鼠IgG分子，再將包被不同分子數(shù)的微球混合，形成含不同羊抗鼠IgG分子數(shù)的混合微球，此微球與待測(cè)標(biāo)本在相同條件下與熒光素標(biāo)記的單克隆抗體（McAb）反應(yīng)后在流式細(xì)胞儀上測(cè)定其熒光強(qiáng)度，根據(jù)微球上所包被的羊抗鼠IgG分子數(shù)和與之對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)熒光強(qiáng)度計(jì)算回歸方程，再將待測(cè)樣本中陽性細(xì)胞的對(duì)數(shù)熒光強(qiáng)度代入方程即可求得其每個(gè)細(xì)胞上的平均抗原分子數(shù)（抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)）。②定量熒光素分子微球法：在特制的微球上直接包被熒光素分子，再將包被不同分子數(shù)的微球混合，形成含不同數(shù)量熒光素分子的混合微球。在流式細(xì)胞儀儀器設(shè)置相同的條件下測(cè)定此微球及待測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，根據(jù)微球上所包被的熒光素分子數(shù)和與之對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)熒光強(qiáng)度計(jì)算回歸方程，再將待測(cè)樣本陽性細(xì)胞的對(duì)數(shù)熒光強(qiáng)度代入方程，可求得每個(gè)細(xì)胞上的平均熒光素分子數(shù)，根據(jù)用于樣本測(cè)定的單克隆抗體（McAb）與熒光素結(jié)合的分子比例，計(jì)算每個(gè)細(xì)胞上的平均抗原分子數(shù)。單細(xì)胞的抗原或受體定量是流式細(xì)胞分析的重要進(jìn)展，為細(xì)胞的生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)及免疫學(xué)等研究提供了更精確的方法。例如，白血病原始細(xì)胞膜的CD45分子表達(dá)量低于正常淋巴細(xì)胞，活化血小板膜CD62P、CD41分子數(shù)顯著高于靜止血小板，活化淋巴細(xì)胞的CD69分子數(shù)顯著，活化中性粒細(xì)胞膜CD64分子數(shù)顯著高于靜止中性粒細(xì)胞，強(qiáng)直性脊柱炎患者T淋巴細(xì)胞膜HLA-B27分子數(shù)明顯。CD8+T淋巴細(xì)胞膜的CD38分子數(shù)是慢性HIV感染者病情發(fā)展或死亡的更有力的預(yù)后指標(biāo)；AIDSZL有效后，CD8+T淋巴細(xì)胞CD38分子數(shù)顯著降低。

三．從單色到多色熒光分析

流式細(xì)胞分析已從Z初的間接免疫熒光染色、單色或雙色直接熒光染色，迅速發(fā)展到三色、四色甚至五色或六色熒光分析，使得對(duì)細(xì)胞亞群的識(shí)別和分選、細(xì)胞功能評(píng)價(jià)等更為精確。目前，淋巴細(xì)胞亞群的分析、白血病免疫表型分析，均應(yīng)使用至少三色以上的熒光分析才更可靠。例如：輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞四色熒光分析的免疫表型為CD3+CD4+CD8—CD45+，慢性淋巴細(xì)胞白血病的異常淋巴細(xì)胞的四色免疫表型為CD5+CD10—CD19+CD45+。多色熒光分析是流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)，有條件時(shí)應(yīng)盡可能地采用。

四．從細(xì)胞膜成份到細(xì)胞內(nèi)成份分析

細(xì)胞膜免疫表型分析是Z重要的流式分析內(nèi)容之一，很多細(xì)胞亞群的檢測(cè)和分選均是以細(xì)胞膜的免疫表型特征為依據(jù)，如T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞分析、白血病免疫分型等。然而，僅有膜免疫表型的分析是不夠的，尤其對(duì)一些細(xì)胞的系列鑒定和功能狀態(tài)分析常常較為困難，而細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)成份的分析則更能反映某些細(xì)胞的系列特征和功能變化。隨著近年來細(xì)胞內(nèi)成分檢測(cè)技術(shù)的不斷完善，細(xì)胞內(nèi)成分檢測(cè)已成為流式細(xì)胞分析的又一個(gè)熱點(diǎn)。例如，急性髓系白血病性原始細(xì)胞漿中檢測(cè)到髓過氧化物酶（MPO）是Z為準(zhǔn)確的系列標(biāo)志，急性B淋巴細(xì)胞白血病性原始細(xì)胞胞漿中檢測(cè)到CD79a是Z為特異的系列標(biāo)志；檢測(cè)T淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)細(xì)胞因子合成的種類及含量和膜CD69分子表達(dá)，是判斷T淋巴細(xì)胞活化及其功能的重要手段，而且還能將輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（Th）進(jìn)一步分成Th1和Th2亞類，在Th1和Th2細(xì)胞漿中可分別合成γ-干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5、IL-10。通過細(xì)胞內(nèi)成分檢測(cè)技術(shù)與多色免疫熒光分析方法相結(jié)合，可檢測(cè)不同細(xì)胞亞群合成的不同細(xì)胞因子（Cytokine），如用五色疫熒光分析血液中淋巴細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)劑刺激后，輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞亞類—Th1細(xì)胞內(nèi)有細(xì)胞因子合成的免疫表型為CD3+CD4+CD8—IFN-γ+IL-1+。

五．液體中可溶性成分的流式細(xì)胞分析

從傳統(tǒng)意義上講，流式細(xì)胞技術(shù)只能分析細(xì)胞及其成分，液體中的可溶性成分則不能進(jìn)行分析。然而，如果將液體中的可溶性成分結(jié)合在一種類似于細(xì)胞大小的顆粒（如乳膠顆粒）上，流式細(xì)胞儀便可以對(duì)其進(jìn)行分析，這就是近年來發(fā)展起來的流式微球分析（Cytometric Bead Assay，CBA）技術(shù)。CBA的原理是將包被某種抗原或抗體不同大小的微球與待測(cè)液體中的相應(yīng)成分反應(yīng)形成抗原與抗體的復(fù)合物，再加入熒光素標(biāo)記的第二抗體，微球上結(jié)合的待測(cè)抗原或抗體分子數(shù)量與其熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，由此可對(duì)待測(cè)液體中與微球上包被抗原或抗體分子相對(duì)應(yīng)的成分進(jìn)行定性或定量分析，例如同時(shí)測(cè)定血清或細(xì)胞培養(yǎng)液中的多種細(xì)胞因子，同時(shí)測(cè)定血清中多種自身抗體。CBA發(fā)展的時(shí)間雖很短，目前所能檢測(cè)的項(xiàng)目還不多，但其發(fā)展?jié)摿Σ蝗莺鲆?。已知檢測(cè)細(xì)胞因子的方法有多種，包括靶細(xì)胞功能分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、斑點(diǎn)酶免疫分析（Elispots）等，但CBA與之相比，其靈敏度極高、可達(dá)2pg/ml，而且能同時(shí)測(cè)定單個(gè)標(biāo)本中的多種細(xì)胞因子。

六．分子表型分析

分子表型分析（Molecular Phenotyping）是指用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中特異性核酸序列或特異性基因異常。流式分子表型分析與免疫表型分析技術(shù)相結(jié)合，為所選擇細(xì)胞亞群的特異性核酸序列（如癌基因、病毒核酸等）檢測(cè)提供了一種非常有用的工具，具有廣闊的應(yīng)用前景。流式分子表型與免疫表型分析結(jié)合的基本技術(shù)路線是：①待測(cè)細(xì)胞首先與特異性細(xì)胞亞群的單克隆抗體反應(yīng)，②固定并滲透細(xì)胞，③通過PCR進(jìn)行引物特異的核酸序列擴(kuò)增，④應(yīng)用對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性寡核苷酸熒光素標(biāo)記探針進(jìn)行熒光原位雜交（FISH），⑤加入針對(duì)細(xì)胞亞群?jiǎn)慰沟臒晒馑貥?biāo)記的第二抗體。⑥流式細(xì)胞儀檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析。例如，流式細(xì)胞免疫表型與聚合酶鏈反應(yīng)及熒光原位雜交（PCR-FISH）結(jié)合測(cè)定血液CD4+細(xì)胞中HIV特異的DNA或RNA，對(duì)于AIDS的病程監(jiān)測(cè)、ZL反應(yīng)以及預(yù)后等具有重要價(jià)值。

流式熒光原位雜交（Flow-FISH）法可測(cè)定染色體端粒長(zhǎng)度。細(xì)胞的染色體端粒是由2~20Kb串聯(lián)的短片段重復(fù)序列(TTAGGG)n和一些結(jié)合蛋白組成，端粒長(zhǎng)度越長(zhǎng)，所含重復(fù)堿基數(shù)目越多；用熒光素標(biāo)記的核酸-(CCCTAA)3端粒序列特異性探針進(jìn)行FISH后，端粒的長(zhǎng)短可以流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度的高低反映出來；Flow-FISH測(cè)定精度可小于3Kb的端粒長(zhǎng)度差，對(duì)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展、ZL與預(yù)后等的研究有一定價(jià)值。