實(shí)驗(yàn)變量多：鋪板密度、DNA負(fù)載、轉(zhuǎn)染試劑體積、孵育時(shí)長(zhǎng)、加樣位置/速度、混勻方式等，手工難以保持跨板一致。

時(shí)序難統(tǒng)一：DNA+P3000與Lipo的孵育/混合到加樣的時(shí)間差，將影響表達(dá)水平。

細(xì)胞鋪板：HEK293，96孔平底黑壁透底板；鋪板密度25,000/50,000 cells/100 μL，按列分布以便條件對(duì)比；鋪板后用i3X MiniMax成像確認(rèn)沉降與狀態(tài)。

轉(zhuǎn)染體系：依據(jù)試劑說(shuō)明，比較DNA 100 vs 400 ng/孔；Lipo 0.15 vs 0.3 μL/孔；P3000比例按說(shuō)明書(shū)添加；Opti-MEM為稀釋體系。

關(guān)鍵時(shí)序：對(duì)每種預(yù)混體系自動(dòng)錯(cuò)開(kāi)啟動(dòng)，使“混合→有效載荷加樣”的孵育，統(tǒng)一為12分鐘；有效載荷液面下約1 mm加樣；緩慢吹吸+傾斜混勻。

培養(yǎng)與檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后37°C，5% CO?培養(yǎng)；用EVOS（明場(chǎng)+GFP）保持一致參數(shù)成像；再以CytoFLEX流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行定量。

過(guò)高DNA濃度可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性。檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果支持這一假設(shè)，在400ng條件下，無(wú)論是在定性熒光成像分析還是定量流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)中，轉(zhuǎn)染效率都有所降低。

在考慮Lipofectamine的劑量時(shí)，我們沒(méi)有觀察到0.15 μL和0.3 μL在下游轉(zhuǎn)染效率方面存在顯著差異，但50000個(gè)細(xì)胞接種密度和高DNA濃度加入的情況除外。未來(lái)的實(shí)驗(yàn)可能考慮降低Lipofectamine濃度來(lái)減少昂貴試劑的消耗，并通過(guò)在25000個(gè)細(xì)胞密度下接種來(lái)減少總細(xì)胞需求。