雙特異性抗體的主要結(jié)構(gòu)

雙特異性抗體（Bispecific Antibody, BsAb）是一種通過基因重組技術(shù)創(chuàng)造的人工抗體，具備同時特異性地靶向并結(jié)合兩個不同抗原或抗原表位的能力。

憑借其獨特的特異性和雙功能性特點，BsAb類藥物已成為生物制藥研究領(lǐng)域的焦點，特別是在腫瘤、炎癥性疾病及自身免疫性疾病等多個醫(yī)療領(lǐng)域，展現(xiàn)出了極為廣闊的應(yīng)用潛力和前景。

雙特異性抗體（BsAbs）的眾多下游工藝開發(fā)策略，很大程度上借鑒并擴展了單克隆抗體（mAbs）已經(jīng)

確立的純化方法。這一做法的合理性在于，BsAbs與mAbs之間確實存在著若干結(jié)構(gòu)上的共通之處，使得mAbs的優(yōu)化純化流程成為探索BsAbs純化工藝的理想起點。

Fig.1 免疫球蛋白G（IgG）單克隆抗體（mAb）以及主要的親和配體結(jié)合位點示意圖

Fig.1清晰地描繪了免疫球蛋白G（IgG）型單克隆抗體（mAb）的結(jié)構(gòu)組成。該抗體由兩條重鏈（HC）和兩條輕鏈（LC）相互交織而成。

具體來說，重鏈（HC）包含了可變重鏈區(qū)（VH）、恒定區(qū)1（CH1）、鉸鏈區(qū)、恒定區(qū)2（CH2）以及恒定區(qū)3（CH3）等多個結(jié)構(gòu)域；而輕鏈（LC）則包括可變輕鏈區(qū)（VL）和恒定輕鏈區(qū)（CL）。其中，VL與VH結(jié)構(gòu)域配對形成抗體的可變片段（Fv），而VL、VH、CL與CH1結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成了抗原結(jié)合片段（Fab），這是抗體與抗原相互識別的關(guān)鍵區(qū)域。另一方面，CH2與CH3結(jié)構(gòu)域則聯(lián)合組成了抗體的可結(jié)晶片段（Fc）區(qū)域。該區(qū)域負責抗體的效應(yīng)功能，如與免疫細胞或補體系統(tǒng)的相互作用。

Fig.1還特別指出了IgG分子上主要的親和配體結(jié)合位點。這些位點以箭頭的形式標記，是設(shè)計純化策略時需要考慮的因素。通過對這些結(jié)構(gòu)細節(jié)和結(jié)合位點的了解，研究人員能夠更有效地開發(fā)出針對BsAbs的純化工藝，從而實現(xiàn)高效、高純度的抗體生產(chǎn)。

根據(jù)BsAb的結(jié)構(gòu)，主要可以將其分為三大類，即（i）非對稱型，（ii）對稱型和（iii）基于片段的BsAbs。它們的結(jié)構(gòu)特性對它們的下游純化策略具有重要意義[1]。其分類主要基于Fig.2展示的三種主要形式：

（i）非對稱型雙抗：這種類型的雙抗通常具有衍生自兩種不同親本mAb的重鏈和輕鏈。其中輕鏈和/或重鏈的部分或全部也可以設(shè)計為在可能的情況下在兩個臂上相等，以最大限度地減少錯誤配對。 

（ii）對稱型雙抗：對稱型雙抗同樣包含F(xiàn)c片段，其兩側(cè)的結(jié)構(gòu)域序列呈現(xiàn)對稱性，通過附加到抗體上的額外抗原識別結(jié)構(gòu)域如scFv來實現(xiàn)多重特異性。

（iii）基于片段的雙抗：這類雙抗由可變區(qū)通過不同的連接方式構(gòu)成，例如BiTE結(jié)構(gòu)（一個scFv的VH與其自身的VL相連，同時也與另一個scFv的VL相連）和Diabody結(jié)構(gòu)（兩個scFv不與其自身的VL和VH相連，而是分別與對方的VH和VL相連）。

Fig.2 雙特異性抗體的三種主要結(jié)構(gòu)

雙特異性抗體的主要副產(chǎn)物

雙特異性抗體的設(shè)計復(fù)雜性經(jīng)常伴隨著多種副產(chǎn)物的產(chǎn)生，這些副產(chǎn)物極大地增加了后續(xù)純化步驟的挑戰(zhàn)性。以下是對幾種主要副產(chǎn)物及其形成原因的分析：

同源二聚體

在細胞培養(yǎng)過程中，由于多種重鏈（HC）和輕鏈（LC）的共表達，雙抗容易發(fā)生HC和LC的錯配現(xiàn)象，導(dǎo)致大量具有相似大小和性質(zhì)的非功能性或單特異性抗體的產(chǎn)生，也稱為同源二聚體。

為了減少錯配，可以通過分子設(shè)計來提高目標雙抗的形成概率。例如，廣泛應(yīng)用的Knob-into-Hole（KiH）技術(shù)，但同源二聚化仍不能被完全消除。

片段缺失

缺失HC或LC的雙抗片段是常見的副產(chǎn)物，例如1/2 BsAb（缺少一條HC和一條LC）和3/4 BsAb（缺少一條LC）。

聚集體形成

雙抗分子的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，形式多樣，而且分子結(jié)構(gòu)特殊，易受到各種物理、化學(xué)和細胞生長壓力的影響而產(chǎn)生聚集體。

研究表明，基于片段的BsAb由于Fc區(qū)的缺失，比傳統(tǒng)的IgG更容易形成聚集體。對稱型BsAb也被觀察到具有較高的聚集體傾向（聚集體比例高達50%）。這種傾向可能部分由于鏈長度和靈活性的增加，導(dǎo)致分子間結(jié)構(gòu)域更容易發(fā)生交換。

對以上三種副產(chǎn)物去除的經(jīng)驗分享

同源二聚體的去除

同源二聚體與雙抗分子的物理化學(xué)性質(zhì)都十分的相似，因此需要結(jié)合目標雙抗分子與同源二聚體之間的結(jié)構(gòu)、親和力、電荷性質(zhì)及疏水性的差異來制定純化策略。

以下為親和、離子交換和復(fù)合模式層析方法對同源二聚體進行分離的具體案例。

• Protein A/L親和層析

Protein A可以特異性地結(jié)合IgG1或IgG4的Fc區(qū)域。通過改變重鏈與Protein A的結(jié)合能力，可以利用Protein A與同源二聚體之間的結(jié)合差異來去除同源二聚體。而不同輕鏈的設(shè)計可避免重鏈錯配，依據(jù)同源二聚體與完整抗體在Kappa輕鏈結(jié)構(gòu)上的親和力差異，使用Protein L填料實現(xiàn)同源二聚體的有效分離。

• 離子交換層析

利用目標雙抗與同源二聚體之間pI的差異，使用離子交換層析進行分離。文獻報道[2]的案例中通過質(zhì)譜確認了目標BsAb的pI為7.24，同源二聚體的pI為8.04。使用Diamond Q（陰離子填料）類型填料，在選定的上樣、淋洗條件（pH7.5和電導(dǎo)率5mS/cm）和上樣載量（80mg/mL）下運行，帶正電荷的同源二聚體從層析填料上流穿，實現(xiàn)了與目標分子的良好分離。

• 復(fù)合模式層析

MMC在離子相互作用的基礎(chǔ)上，另外具備了疏水、氫鍵和嗜硫作用，可利用同源二聚體與目標雙抗在疏水性以及表面電荷上的差異對其進行去除。

文獻報道[3]的案例中，使用Diamond MMC Mustang（陽離子復(fù)合填料）類型填料，在選定的上樣條件（即pH5.5和電導(dǎo)率5mS/cm）和上樣載量（30mg/mL）下運行，通過優(yōu)化淋洗步驟，將淋洗條件優(yōu)化為50mM His-HCl, 63mM NaCl, pH6.5，可以有效去除半抗和Knob-Knob同源二聚體。雖然Knob-Knob同二聚體結(jié)合比半抗體略強，但比靶BsAb弱得多，仍然可以在淋洗步驟被去除。

低分子量片段的去除

半抗體是雙抗分子組裝過程一種常見的副產(chǎn)物，是由于部分重鏈或輕鏈過表達，并且由于空間位阻等原因無法形成同源二聚體而產(chǎn)生的雜質(zhì)。3/4抗體則主要是由于二硫鍵斷裂導(dǎo)致雙抗分子的一條輕鏈缺失所產(chǎn)生的雜質(zhì)。

以下為通過親和、復(fù)合模式、離子交換層析方法對半抗、3/4抗等低分子量片段進行分離的具體案例。

• Protein A親和層析

半抗僅含一個Fc區(qū)，相較于含兩個Fc區(qū)域的目標抗體分子來說，半抗與親和填料結(jié)合能力弱，比目標分子更早洗脫，可通過pH線性梯度或等度pH洗脫去除。

• 復(fù)合模式層析

MIX-A除了陰離子作用外，還具有疏水及氫鍵作用，可有效去除聚體、DNA、宿主蛋白、內(nèi)毒素、Protein A等雜質(zhì)。

在測試的對稱型雙抗案例中，使用Diamond MIX-A Mustang（陰離子復(fù)合填料），在選定的上樣條件（pH7.0）和上樣載量（30mg/mL）下運行，通過優(yōu)化淋洗步驟，將淋洗條件優(yōu)化為20mM PB, 0.3M Arg-Cl, pH7.0，可以有效地去除ScFv缺失的副產(chǎn)物，且不會淋洗出目的蛋白，洗脫產(chǎn)品SEC純度提高了8%。

• 離子交換層析

利用目標雙抗與低分子量片段之間所帶電荷的差異，使用離子交換層析通過pH或者鹽梯度進行分離。

在測試的雙抗案例中，BsAb的pI為7.7，使用MegaPloy BXS（陽離子填料），在選定的上樣條件（pH6.0）和上樣載量（60mg/mL）下運行，洗脫步驟使用A: 20mM Citrate-Na, pH6.0和B: 20mM Citrate-Na, 0.3M NaCl, pH6.0, 進行0~100% B線性梯度洗脫。層析圖譜上發(fā)現(xiàn)低分子量的片段在洗脫峰尾出現(xiàn)了單獨的第二個較小的洗脫峰，通過SEC-HPLC和NR CE-SDS檢測，發(fā)現(xiàn)收集產(chǎn)品SEC提高了8.7%，CE-NR提高了10.5%，說明片段被明顯去除。

在測試的相同雙抗案例中，使用Diamond CD-S（陽離子填料），在選定的上樣條件（pH6.0）和上樣載量（60mg/mL）下運行，洗脫步驟使用A: 20mM Citrate-Na, pH6.0和B: 20mM Citrate-Na, 0.3M NaCl, pH6.0, 進行0~100% B線性梯度洗脫。層析圖譜上發(fā)現(xiàn)低分子量的片段在洗脫峰尾同樣出現(xiàn)了單獨的第二個較小的洗脫峰，通過SEC-HPLC和NR CE-SDS檢測，發(fā)現(xiàn)收集產(chǎn)品SEC提高了7.3%，CE-NR提高了11.0%，說明片段同樣能夠被Diamond CD-S有效去除。

高分子量聚集體的去除

在雙特異性抗體生產(chǎn)過程中，由于肽鏈的延伸提高了肽鏈的長度和靈活性，加劇了分子間的肽鏈纏繞，使得聚集體極易形成。此外，親和層析低pH洗脫條件也容易造成聚集體的形成。

以下為通過疏水和復(fù)合模式層析方法對高分子量聚集體進行分離的具體案例。

• 疏水層析

疏水層析在去除聚集體上效果突出。聚集體的疏水性比單體強，疏水層析可通過目標分子流穿模式去除聚集體。對于自身疏水性很強的目標分子可選用疏水性相對較弱的Octyl、Butyl填料篩選上樣條件，也可選用高分辨疏水填料進行洗脫分離聚體和目標抗體。

文獻報道[4]的案例中，目標產(chǎn)品為對稱型雙抗，首先使用Phenyl Bestarose HP（疏水填料）類型填料進行常規(guī)的遞減硫酸鈉梯度洗脫，以確定基線純度和回收率水平。在pH8下，使用遞減的硫酸鈉線性梯度（0.4~0M）進行洗脫，層析圖譜上發(fā)現(xiàn)洗脫峰分離效果不明顯，收集產(chǎn)品在SEC大于99%的純度下，收率僅為35.7%。通過優(yōu)化后的洗脫條件，在使用遞減的硫酸鈉線性梯度（0.4~0M）上疊加遞增的精氨酸（0~1M）線性梯度，層析圖譜上洗脫峰出現(xiàn)明顯的拖尾，同時收集產(chǎn)品在SEC大于99%的純度下，收率為81.7%，提高了46%，說明聚集體與目標產(chǎn)品明顯分離。

• 復(fù)合模式層析

Diamond MMC Mustang在雙抗的精純上應(yīng)用非常廣泛，對降解片段、電荷異構(gòu)體以及聚集體等副產(chǎn)品有較好的去除效果。

文獻報道[5]的案例中，目標產(chǎn)品為非對稱型雙抗，使用Diamond MMC Mustang（復(fù)合模式填料），在選定的上樣條件（硫酸銨濃度調(diào)節(jié)到1M，pH7.0）和載量（30mg/mL）下運行，洗脫步驟使用A: 50 mM Tris-HAc, 1 M (NH₄)₂SO₄, pH7.0和B: 50 mM Tris-HAc, pH7.0, 進行0~100% B線性梯度洗脫。

通過Fig.3可以發(fā)現(xiàn)半抗以及高分子量雜質(zhì)在洗脫峰尾富集，并且與目標雙抗明顯的分離。在這種情況下，主要是利用目標雙抗和高分子量聚集體之間疏水性差異實現(xiàn)分離。同時根據(jù)圖譜來看，Diamond MMC Mustang與某進口復(fù)合模式填料（MMC）在分離效果和產(chǎn)品質(zhì)量上基本保持一致。

Fig.3 使用Diamond MMC Mustang和某進口復(fù)合模式層析柱在線性鹽梯度洗脫條件下的疊加層析圖譜

總結(jié)

BsAb的復(fù)雜結(jié)構(gòu)帶來了多種純化挑戰(zhàn)，但通過合理的設(shè)計和純化策略，可以有效提高目標BsAb的純度和產(chǎn)量。這些策略包括親和層析、離子交換層析、復(fù)合模式層析和疏水層析等，每種方法都有其特定的應(yīng)用場景和優(yōu)勢。

通過使用不同層析原理的填料進行有效組合，使得雜質(zhì)在精純層析步驟中盡可能多的去除，得到穩(wěn)健的下游工藝，使雙特異性抗體產(chǎn)品質(zhì)量滿足放行要求。

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參考文獻

[1] Chen, Serene W, and W. Zhang. (2021)Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies. Antibody Therapeutics 

[2] Chen, Wei, et al. (2023)Resin and loading condition screening for effective and robust byproducts removal by anion exchange chromatography: A case study.  Protein expression and purification 

[3] Tang, Jiaqin, et al. (2020)Removal of half antibody, hole-hole homodimer and aggregates during bispecific antibody purification using MMC ImpRes mixed-mode chromatography.  Protein expression and purification

[4] Hall, Troii, G. M. Kelly, and W. R. Emery. (2018)Use of mobile phase additives for the elution of bispecific and monoclonal antibodies from Phenyl Sepharose HP and Capto Phenyl ImpRes Resins. Journal of Chromatography B 

[5] Zhang, Shengwei, et al. (2021)Evaluating a new mixed-mode resin Diamond MMC Mustang using Capto MMC ImpRes as a benchmark. Protein Expression and Purification