介紹
與傳統(tǒng)的 2D 培養(yǎng)模型相比，3D 球體模型能夠更好地模擬腫瘤的體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)和代謝情況，因此癌癥研究的 3D 球體模型越來(lái)越受歡迎 1,5,6。先前的研究表明，3D 培養(yǎng)顯示出多種體內(nèi)腫瘤特征，如細(xì)胞 - 細(xì)胞 /ECM 相互作用、藥物外顯率、劑量反應(yīng)和耐藥性 7。與實(shí)體瘤相似，球狀體由外部細(xì)胞增殖區(qū)、中層靜止細(xì)胞和內(nèi)部壞死核心組成，這些壞死核心細(xì)胞暴露在缺氧條件下。這些相似之處表明，3D 模型將有助于更好地評(píng)估藥物安全性，并有助于成功識(shí)別抗腫瘤化合物 4。針對(duì) 3D 細(xì)胞球培養(yǎng)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種各樣的技術(shù)。原則上，這些方法使用細(xì)胞附著抵抗表面或物理力量來(lái)促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶 /NASA 生物反應(yīng)器系統(tǒng)使用連續(xù)運(yùn)動(dòng)來(lái)防止細(xì)胞粘附在培養(yǎng)瓶表面，從而促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附。磁懸浮法利用磁場(chǎng)將含有納米顆粒的氧化鐵細(xì)胞團(tuán)簇在一起形成球狀體。而旋瓶法和磁懸浮法會(huì)產(chǎn)生大量的球狀體，均勻性差，球狀體比例低 2。懸滴法是將細(xì)胞懸浮液滴在培養(yǎng)皿的底部。然后將這些液滴中形成的球狀體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)。

優(yōu)勢(shì)

? 便于增加每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下的細(xì)胞球數(shù)量

? 大量的細(xì)胞球可同時(shí)培養(yǎng)、染色和成像
? 使用高內(nèi)涵成像，同時(shí)對(duì)多個(gè)細(xì)胞球或類器官進(jìn)行3D 分析

在沒(méi)有自動(dòng)化條件下，這項(xiàng)技術(shù)是勞動(dòng)密集型且時(shí)間消耗大，因此限制了它只能在小范圍內(nèi)被研究和應(yīng)用。目前，一種流行的產(chǎn)生細(xì)胞球的方法是使用鍍有低附著材料的 u 形底孔的板。這種無(wú)支架的方法提供了一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的工作流程，并與高內(nèi)涵成像兼容。此外，細(xì)胞球尺寸易于控制，球體的均勻度高 2。以前的工作是用一步染色法優(yōu)化圓形底板的工作流程，這樣可以減少分析時(shí)間并使變量Z小化 3。然而，使用 u 型底板的一個(gè)缺點(diǎn)是，在每個(gè)孔中只能生成一個(gè)單一的細(xì)胞球。為了增加數(shù)據(jù)點(diǎn)，需要重復(fù)的孔，這是一項(xiàng)耗時(shí)的工作，Z終會(huì)增加試劑和測(cè)試化合物的使用量，從而提高篩選成本。

在低附著表面上形成微孔陣列的方法可以產(chǎn)生多個(gè)大小一致的細(xì)胞球?？祵??Elplasia? 板在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)板 ( 6 孔、24 孔、96 孔 ) 內(nèi)設(shè)計(jì)有微腔。每個(gè)孔都涂有極低的附著面，以形成球體。與 u 型板標(biāo)準(zhǔn)工作流程中每個(gè)孔生成一個(gè)球相比，Elplasia 板在 96 孔中平均每個(gè)孔可生成 78個(gè)球。這允許在相同的條件下生長(zhǎng)和處理多個(gè)細(xì)胞球，從而Z大化數(shù)據(jù)輸出。此外，該方法可用于研究腫瘤組織的克隆異質(zhì)性，增加用于基因表達(dá)或代謝組學(xué)分析的材料數(shù)量 5,8。
本文中我們展示了 Elplasia 96 孔板的使用，以及 3D 培養(yǎng)流程，包括球體生成、化合物處理、細(xì)胞毒性分析、ImageXpressMicro 共聚焦高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)的高內(nèi)涵成像，以及使用 MetaXpress? 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件進(jìn)行 3D 圖像分析。能夠輕松生成多個(gè)球狀體，并將工作流程與高內(nèi)涵成像無(wú)縫集成的能力，將在藥物發(fā)現(xiàn)和化合物毒理學(xué)方面有重大應(yīng)用。

方法
細(xì)胞培養(yǎng)
使用 HCT116 細(xì)胞系 (ATCC) 生成細(xì)胞球。Elplasia 板是預(yù)濕的，并根據(jù)制造商的 protocol 進(jìn)行處理。在Elplasia 96 孔板 (#4442) 中，在總共 100 毫升的 McCoy培養(yǎng)基 ( 補(bǔ)充 10% 胎牛血清 ) 中，50,000 個(gè)細(xì)胞被包裹在 Elplasia 96 孔板 (#4442) 中。細(xì)胞在 37℃ 下孵育 24小時(shí)，在化合物處理前形成細(xì)胞球。在加入化合物之前，細(xì)胞在組織培養(yǎng)顯微鏡上進(jìn)行肉眼觀察，以驗(yàn)證細(xì)胞球的形成。本實(shí)驗(yàn)中使用了以下化合物：阿糖胞苷，阿霉素 (Dox)，依托泊苷，星孢素和紫杉醇?；衔锇凑?1:5 稀釋，和對(duì)照組一起，在重復(fù)孔中進(jìn)行測(cè)試。細(xì)胞球與化合物共孵育六天，新鮮化合物在第三天加入。
染色
對(duì)于活細(xì)胞毒性實(shí) 驗(yàn)，細(xì)胞球用以下染 料的混合物染色，Z終濃度如下：3 μM 的 Calcein AM (LifeTechnologies)、2 μM 的 溴 乙 啡 錠 二 聚 體 III (EthD-III)(Molecular Devices) 和 33 μM 的 Hoechst 33342 (LifeTechnologies)。在使用前立即配制染料溶液，每孔加 10μL。在成像前，細(xì)胞球在 37℃ 的染料中孵育兩個(gè)半小時(shí)。

圖像采集
圖像獲取使用 ImageXpress Micro 共聚焦高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng) (Molecular Devices)，使用 10X 物鏡。共聚焦轉(zhuǎn)盤的針孔尺寸 = 60 μm。實(shí)驗(yàn)中采集了 12 幅圖像的Z-stack 圖像集，Z 層步階為 5 μm，覆蓋至少一半的細(xì)胞球體積。
分析
使用 MetaXpress 軟件中的自定義模塊編輯器進(jìn)行 3D 圖像分析。通過(guò)使用 Hoechst 染色圖像與 3D 功能“ 發(fā)現(xiàn)球形物體 ”的算法來(lái)分析識(shí)別球體。采用 Hoechst 染色的細(xì)胞核計(jì)數(shù)模塊識(shí)別細(xì)胞總數(shù)。活 / 死模塊用于定量死亡細(xì)胞 (EthD 陽(yáng)性 ) 和活細(xì)胞 ( Hoechst 陽(yáng)性，Eth 陰性 ) 的數(shù)量。因?yàn)樗兰?xì)胞可能不再顯示 Hoechst 染色，細(xì)胞分類模塊用于識(shí)別所有 EthD 陽(yáng)性細(xì)胞。利用Z優(yōu)匹配算法將所有平面上的總細(xì)胞、活細(xì)胞和死細(xì)胞的物體 Mask 連接起來(lái)形成三維對(duì)象。使用 SoftMax Pro 軟件使用 4 參數(shù) logistic 曲線擬合進(jìn)行劑量反應(yīng)分析。統(tǒng)計(jì)分析和圖表用 Microsoft Excel 完成。

結(jié)果
典型的無(wú)支架產(chǎn)生細(xì)胞球的方法是使用超低附 u 型底板，每個(gè)孔產(chǎn)生一個(gè)橢球體。為了增加數(shù)據(jù)點(diǎn)，需要重復(fù)檢測(cè)多個(gè)孔，這通常是勞動(dòng)密集型的，并Z終大大增加了篩選成本。Elplasia 的 96 孔板可以在一個(gè)孔中形成多達(dá)78 個(gè)球體，每個(gè)球體都安置在一個(gè)微腔中。在這些微腔槽中形成的球體在大小和形狀上是一致的，從而提高了再現(xiàn)性 ( 圖 1 )。該板與 ImageXpress 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)兼容，允許根據(jù)所使用的檢測(cè)方法進(jìn)行不同的生物信息讀出。
細(xì)胞球用不同類別的抗腫瘤化合物處理 6 天，然后評(píng)估細(xì)胞存活率。用 Hoechst ( 細(xì)胞核 )、Calcein AM ( 活細(xì)胞 ) 和 EthD ( 死細(xì)胞 ) 染色 ( 圖 2 和圖 3 )。為了減少對(duì)球體的干擾，簡(jiǎn)化染色過(guò)程，染色液留在孔中，孵育結(jié)束后不用清洗掉。為了量化化合物處理對(duì)細(xì)胞存活率的影響，我們使用具有 3D 分功能的自定義模塊編輯器 (CME) 在MetaXpress 軟件中對(duì)圖像進(jìn)行分析。測(cè)量細(xì)胞球直徑、體積、死亡細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)。

觀察化合物處理的細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制作用。總的來(lái)說(shuō)，我們觀察到所有化合物的活細(xì)胞數(shù)量 ( EthD 陰性 ) 都減少了。死亡細(xì)胞 ( EtHD 陽(yáng)性細(xì)胞 ) 數(shù)量增加，特別是星孢素和阿霉素處理后，表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用。在紫杉醇和依托泊苷的作用下，細(xì)胞總數(shù)減少，主要表現(xiàn)為在測(cè)試濃度下的細(xì)胞抑制作用 ( 圖 4C 和 4D )。在處理過(guò)的細(xì)胞球中觀察到活細(xì)胞的濃度依賴性下降。阿糖胞苷、阿霉素和阿糖胞苷的處理導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)的濃度依賴性下降，死亡細(xì)胞數(shù)相應(yīng)增加。紫杉醇處理的細(xì)胞球顯示球體的大小減少，但活細(xì)胞計(jì)數(shù)沒(méi)有減少，表明細(xì)胞抑制作用。在較高的紫杉醇濃度 (13.3 μM) 下觀察到細(xì)胞毒性，同時(shí)活細(xì)胞數(shù)減少 3 倍。

通過(guò)測(cè)量球體的直徑和體積，我們還評(píng)估了化合物對(duì)球體大小的影響 ( 圖 4B )。有趣的是，經(jīng)化合物處理的細(xì)胞球（ 阿糖胞苷、阿霉素、星孢素和紫杉醇 ）與對(duì)照樣品相比，觀察到的直徑?jīng)]有顯著差異。然而，與對(duì)照組相比，處理后的球體體積明顯減少。減少球體體積而不減少直徑表明一個(gè)坍縮的球體結(jié)構(gòu)，其中三維形態(tài)不再保持。由于直徑可以通過(guò)二維分析來(lái)測(cè)量，體積和直徑的差異表明三維分析對(duì)于研究化合物毒性對(duì)球體的影響更具有代表性。
雖然球形活細(xì)胞的數(shù)量可以用來(lái)確定引起表型變化的化合物的有效濃度，但 3D 分析的其他檢測(cè)參數(shù)可以提供關(guān)于特定影響的額外信息 ( 例如死亡細(xì)胞的數(shù)量、總細(xì)胞數(shù)量和熒光強(qiáng)度 )。

圖 1 康寧 Elplasia 板可產(chǎn)生多個(gè)球體。圖中是 96 孔 Elplasia 板中的一個(gè)孔。使用 4x 物鏡 ( 4 個(gè)位點(diǎn)，然后拼接 ) 獲取圖像。圖中展示了透射光和熒光圖像。球體大小和形狀的可變性常常影響結(jié)果的再現(xiàn)性。測(cè)量球體的直徑和形狀因子 ( 圓度的測(cè)量，1 表示一個(gè)完美的圓 ) 以評(píng)估球體的均勻性。圖表顯示了八個(gè)對(duì)照孔的平均形狀因子和平均球體直徑 ( 標(biāo)準(zhǔn)誤差 )。

圖 2 對(duì)照組和化合物處理后球體的代表性圖像。細(xì)胞球用 Hoechst 染料 ( 藍(lán)色 ) 染色核，用 Calcein AM 染色活細(xì)胞 ( 綠色 )，用EthD 染色死細(xì)胞 ( 紅色 )。使用 z-stack 功能，用 10X 物鏡進(jìn)行成像。顯示的結(jié)果為Z大投影圖像。化合物處理后的細(xì)胞球表現(xiàn)出一系列的表型效應(yīng)，大多數(shù)球體失去了緊湊的球狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞脫離了主球狀體。

圖 3 用不同濃度的阿糖胞苷和星孢素處理細(xì)胞球。注意兩種不同化合物造成的球狀結(jié)構(gòu)上的不同。阿糖胞苷處理后導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不緊密，細(xì)胞脫離球體。星孢素處理的結(jié)果是分散和扁平的球形形態(tài)，有大量的死亡細(xì)胞，特別是在高濃度下。

圖 4 對(duì)細(xì)胞球的細(xì)胞毒性作用顯示為對(duì)照和化合物處理的細(xì)胞。A) 展示了對(duì)照組的單一平面和阿糖胞苷處理 (13.3 μM) 球體的圖像分析 Mask。中間一列顯示球形和活細(xì)胞的 Mask(EthD 陰性 )。右側(cè)列為死細(xì)胞 Mask ( EthD 陽(yáng)性 )。B) 除依托泊苷外，與未加化合物處理的球體相比，經(jīng)處理的球體直徑無(wú)明顯變化。相比之下，經(jīng)過(guò)處理的球狀體體積減少了 20% 到 40%。*p< 0.05， **p<0.01，***p<0.001。阿糖胞苷 (333 μM)、阿霉素 (1.3 μM)、依托泊苷 (333 μM)、星孢素 (33.3 μM)、紫杉醇 (67 μM)。C) 平均每個(gè)細(xì)胞球中，化合物處理后的活細(xì)胞較少，死細(xì)胞較多 (p<0.001)。D) 用 4 參數(shù)曲線擬合出每個(gè)球體的平均活細(xì)胞數(shù)與化合物濃度的關(guān)系。EC 值為：阿糖胞苷 = 0.128 μM，阿霉素 = 0.156 μM，星孢素 = 31.78 μM，紫杉醇 = 13 μM。星孢素和紫杉醇的高 EC 值表明這些化合物在觀察到細(xì)胞毒性之前具有細(xì)胞抑制作用。
結(jié)論
我們發(fā)現(xiàn)，在康寧 Elplasia 96 孔板中，經(jīng)過(guò)化合物處理、染色，然后在 ImageXpress Micro 共聚焦高內(nèi)涵系統(tǒng)上成像，可以很容易生成多個(gè)球狀體。使用 MetaXpress 軟件對(duì)細(xì)胞球進(jìn)行三維圖像分析，可以定量評(píng)估化合物對(duì)球狀體的效應(yīng)。這樣的從樣本制備到結(jié)果分析的完整工作流程已經(jīng)優(yōu)化為可應(yīng)用于 3D 培養(yǎng)的快速高通量藥物篩選。