介紹
Cannabis sativa在美國(guó)許多州變得合法化，州立機(jī)構(gòu)正在為種植者、零售商、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室制定自己本地的法規(guī)和要求。比如，2019 年 1月，加州在當(dāng)?shù)胤苫A(chǔ)上，開始實(shí)施Cannabis sativa相關(guān)法規(guī)，所有的Cannabis sativa商品都必須經(jīng)過檢測(cè)，以確保消費(fèi)者安全。Cannabis sativa中的潛在污染物包括霉菌毒素，曲霉菌屬真菌的有毒產(chǎn)物，食用后可導(dǎo)致人類或動(dòng)物患病和死亡。加州Cannabis sativa管控局要求對(duì)Cannabis sativa產(chǎn)品進(jìn)行Z常見和Z危險(xiǎn)的霉菌毒素測(cè)試：黃曲霉毒素 B1, B2,G1, G2，赭曲霉素 A。這些毒素的上限是 20 ppb，與 FDA 對(duì)大多數(shù)食品規(guī)定的水平相同。其他州對(duì)黃曲霉毒素水平有自己的要求。
試紙條檢測(cè) (Strip test) 和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 是兩種常見的、成本相對(duì)較低的食品和飼料樣品中霉菌毒素檢測(cè)
方法。ELISA 是 在 96 孔板上操 作，具有高通量的優(yōu) 點(diǎn)；而在試紙條上，一 次只能檢測(cè)兩個(gè)樣品。AgraQuant Total
Aflatoxin 4/40 ELISA kit (Romer Labs) 試劑盒可用于定量食品和飼料成分中的黃曲霉毒素，具有同時(shí)檢測(cè) 44 個(gè)不同樣品的能力，當(dāng)需要檢測(cè)大量的樣品時(shí)，可以節(jié)省大量的時(shí)間。在此，我們闡述了 AgraQuant Total Aflatoxin 4/40 ELISA 試劑盒如何與 SpectraMax ABS Plus 酶標(biāo)儀、SpectraMax iD5多功能酶標(biāo)儀聯(lián)用，檢測(cè)Z常見的Cannabis sativa產(chǎn)物之一 - 花當(dāng)中的黃曲霉毒素 B1、B2、G1 和 G2 的水平。樣品的制備和 ELISA 的一般流程如圖 1 所示。

優(yōu)點(diǎn)
? 節(jié)約時(shí)間和成本，高通量、低成本的 ELISA 方法，
? 在單個(gè)提取產(chǎn)物中分析多種黃曲霉毒素，
? 使用 SoftMax Pro 軟件可以快速評(píng)估數(shù)據(jù)結(jié)果。

材料
? AgraQuant Total Aflatoxin 4/40 ELISA 試劑盒 (Romer Labs cat. #10002098)
? AflaStar R Rapid Clean-Up IAC 柱子(Romer Labs cat. #10001963)
? Aflatoxin B1 Standard 標(biāo)準(zhǔn)品 (Sigma cat. #34029)
? Cannabis flower Cannabis sativa的花卉 ( 加州藥房獲取 )
? Methanol, HPLC grade 甲醇，HPLC 級(jí) (Sigma cat. #34860)
? Ammonium acetate 醋酸銨 (Sigma cat. # 73594)
? SpectraMax ABS Plus 酶標(biāo)儀 (Molecular Devices)
? SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀 (Molecular Devices)

方法
制備樣品
將Cannabis sativa樣本放在一個(gè)塑料袋里，用手壓碎。稱量 1 克樣本并將其放入 4 個(gè) 50 mL 的錐形管中。然后在樣本中分別添加 0、10、20 和 30 ppb 黃曲霉毒素 B1 標(biāo)準(zhǔn)品。再加入 20 mL 70%甲醇至樣本中，劇烈渦旋 3 分鐘。所得提取物通過 Whatman1 級(jí)濾紙過濾到干凈的 50 mL 錐形管中。在每一個(gè)提取、過濾得到的樣品中，吸取 4 mL 至干凈的錐形管中，并加入 20 mL 去離子水。總的 24 mL 溶液通過免疫親和層析柱 (IAC) 純化。樣品中的黃曲霉毒素與層析柱中的抗體選擇性結(jié)合。用 20 mL 0.5 M 醋酸銨沖洗柱子，將未結(jié)合的物質(zhì)沖洗掉。Z后用 1 mL 100% 甲醇洗脫樣品，收集于干凈的試管中。
黃曲霉毒素 ELISA 檢測(cè)方法
每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的稀釋孔放置于微孔板條固定器中，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。將等量抗體包被的微孔放置在單獨(dú)的板條固
定器 ( ELISA 板 ) 中。未使用的微孔放回帶有干燥劑的鋁箔袋中。每個(gè)稀釋孔加入 100 uL 的偶聯(lián)物，然后加入 50 uL 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品。根據(jù)試劑盒方案，偶聯(lián)物與樣品保持2:1 的比例?？變?nèi)溶液用 8 通道移液器混合均勻。每種稀釋溶液取 100 uL 轉(zhuǎn)移到 ELISA 板的抗體包被過的微孔中，室溫孵育 15 分鐘。孵育后，用去離子水清洗 ELISA 板 5 次。向板中加入100 uL 底物，室溫孵育 5 分 鐘。 加入 100 uL 終止液，用SpectraMax ABS Plus 和 SpectraMax iD5 酶標(biāo) 儀測(cè)量樣品在 450 nm 波長(zhǎng)下的吸光度。

結(jié)果
用 SoftMax Pro 軟件繪制黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線，由 4、10、20 和 40 ppb 標(biāo)準(zhǔn)品組成 ( 圖 2 和圖 3 )。軟件計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)合百分比 (%B/B0)。B 是每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的平均吸光度值(OD)， B0 是 0 ppb 標(biāo)準(zhǔn)品的平均吸光度值。不含抗原的孔(B0) 吸光度值Z大。

圖 2 在 SoftMax Pro 軟件中繪制黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線。 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品在 4、10、20、40 ppb 的 Log(B/B0) vs. Log (Concentration)。R2 =0.997。標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)由 SpectraMax ABS Plus 酶標(biāo)儀測(cè)得。

圖 3 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品曲線在 4、10、20、40 ppb 的 Log(B/B0) vs.Log (Concentration)。 R2 = 0.998。標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 的 數(shù) 據(jù) 由 SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀測(cè)得。
使用 SoftMax Pro 軟件中的公式編輯器和分組表格計(jì)算 %B/B0 值和 Log (B/B0) 值。這些分析方法建立好后，保存為軟件中的模板，便于在將來的實(shí)驗(yàn)中自動(dòng)化分析數(shù)據(jù)結(jié)果。待測(cè)樣本中黃曲霉毒素的百分回收率通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得。10、20、30 ppb 的三個(gè)待測(cè)樣本測(cè)得回收率在 71% 至 112%，符合推薦的標(biāo)準(zhǔn) ( 表 1 )。

結(jié)論
相比于檢測(cè)試紙條等方法，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)易于使用，靈敏度高，可以處理大量的測(cè)試樣品。AgraQuant Total
Aflatoxin 4/40 ELISA 試劑盒能夠定量黃曲霉毒素的水平，以確保食品和飼料產(chǎn)品的安全。此實(shí)驗(yàn)方法可用于檢測(cè)添加有黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的Cannabis sativa花卉提取物中的黃曲霉毒素回收率。使用 SpectraMax ABS Plus 和 SpectraMax iD5 酶標(biāo)儀獲取數(shù)據(jù)。使用 SoftMax Pro 軟件分析結(jié)果，證實(shí)待測(cè)樣品與添加了黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的樣本中的黃曲霉毒素含量一致。