前言
建立生理相關(guān)的體外模型對(duì)于進(jìn)一步了解神經(jīng)疾病的機(jī)制以及靶向藥物開(kāi)發(fā)至關(guān)重要。iPSC 衍生的神經(jīng)元顯示出對(duì)化合物篩選和疾病建模的巨大希望，然而目前已經(jīng)出現(xiàn)了使用三維 (3D) 培養(yǎng)物作為對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的測(cè)定開(kāi)發(fā)的有效方法。3D 培養(yǎng)被認(rèn)為是更接近人類組織的重演方式，包括結(jié)構(gòu)，細(xì)胞組織，以及細(xì)胞 - 細(xì)胞和細(xì)胞 - 基質(zhì)相互作用1,2。
本研究的重點(diǎn)是利用微流控 OrganoPlate平臺(tái)培育的 iPSC 衍生神經(jīng)元開(kāi)發(fā)高通量 3D神經(jīng)突向外生長(zhǎng)測(cè)定方案，目標(biāo)是建立神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)毒理學(xué)篩查的 3D 模型 3。OrganoPlate 是一個(gè)高通量平臺(tái)，結(jié)合了新近的 3D 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，Phaseguides?和微流體技術(shù) 4,5,6。OrganoPlate 包含 96 個(gè)適合長(zhǎng)期培養(yǎng)活細(xì)胞的組織芯片，適用于篩選目的，并且與標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備或自動(dòng)化系統(tǒng)兼容，如 ImageXpress Micro Confocal高內(nèi)涵成像系統(tǒng)。
材料
? OrganoPlate 平臺(tái) (MIMETAS)
? 人源 iPS 誘導(dǎo) iCell 神經(jīng)元細(xì)胞(Cellular Dynamics International)
? 神經(jīng)基質(zhì)(Cellular Dynamics International)
? 人工基底膜 (Corning)
? 鈣熒光素乙酰氧基甲酯(Life Technologies)
? MitoTracker Orange(Life Technologies)
? Hoechst (Life Technologies)
? 皂素 (Sigma)

? PBS(Sigma)
? Αντι-β-tubulin III(TUJ-1) 抗體 (BD Biosciences)
? ImageXpress Micro Confocal 高內(nèi)涵成像系統(tǒng) (Molecular Devices)
? MetaXpress 高內(nèi)涵圖像拍攝及分析軟件， Ver 6.2 (Molecular Devices)
3D 模型中神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的形成
使用微流體培養(yǎng)模式進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，化合物處理和細(xì)胞染色步驟。對(duì)在 3D 基質(zhì)中培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行共聚焦成像和分析方案的優(yōu)化，用于評(píng)估形態(tài)學(xué)表型和活力。與Matrigel 預(yù)混合，使 OrganoPlate 中Matrigel 終濃度為 7mg / ml ，然后將人iPSC 衍生的神經(jīng)元以 30,000 個(gè)細(xì)胞/芯片的密度接種。接種 Matrigel 細(xì)胞懸浮液時(shí)保持在冰上操作。該溶液的接種體積在每片 1-1.4 μL 之間變化，取決于細(xì)胞密度和基質(zhì)膠濃度。接種后，將板置于組織培養(yǎng)箱 (37℃，5％ CO2) 中 30 分鐘，以促進(jìn)基質(zhì)膠的聚合。接下來(lái)，將 50 μL 生長(zhǎng)培養(yǎng)基添加到芯片的中間入口和出口，然后放回組織培養(yǎng)箱中。在平板接種后約 24 小時(shí)形成神經(jīng)突向外生長(zhǎng)，并持續(xù)培養(yǎng) 14 天。為了評(píng)估 OrganoPlate 平臺(tái)測(cè)試神經(jīng)毒性和神經(jīng)元發(fā)育的可行性，這些神經(jīng)元培養(yǎng)物用一系列已知的抑制神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的化合物進(jìn)行處理 7。在鋪板后 24 小時(shí)開(kāi)始
化合物處理。將培養(yǎng)物暴露于外源處理下 5天，在此期間每隔一天更換含有化合物的培養(yǎng)基。在添加到 OrganoPlate 芯片的介質(zhì)入口和出口之前在介質(zhì)中施加適當(dāng)?shù)腪終稀釋液來(lái)進(jìn)行化合物稀釋。

優(yōu)勢(shì)
? 使用 iPSC 衍生神經(jīng)元建立高通量 3D 神經(jīng)突向外生長(zhǎng)測(cè)定
? 使用微流體 OrganoPlate 平臺(tái)生成更多模擬體內(nèi)結(jié)果
? 優(yōu)化高內(nèi)涵成像，評(píng)估對(duì)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的治療效果

使用透射光成像隨時(shí)間監(jiān)測(cè)神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)的形成。為了評(píng)估神經(jīng)元活力，使用三種染料的混合物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活體染色：活
性染料 Calcein AM (1 μM)，線粒體染料MitoTracker Orange (1 μM) 和 Hoechst核染料 (2 μM)。將染料混合物加入到芯片中并孵育 60 分鐘，然后用培養(yǎng)基替換?；蛘?，將細(xì)胞固定在 4％ 甲醛中，用 0.01％皂苷溶液在 PBS 中進(jìn)行穿透，并使用抗β - 微 管蛋白III (TUJ-X1) 的神經(jīng)元標(biāo)記物 ( 1 :100 稀釋 ) 的熒光基團(tuán)抗體進(jìn)行染色。 細(xì)胞核用 Hoechst 染色。染色固定細(xì)胞時(shí)用一抗在 4 ℃ 下孵育過(guò)夜。
3D 培養(yǎng)的表型分析
通過(guò)高通量的成像和分析來(lái)進(jìn)行對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的治療效果的評(píng)估。我們優(yōu)化了共焦成像和分析方案，在這個(gè) 3D 模型內(nèi)評(píng)估神經(jīng)元的形態(tài)和生存能力。使用 ImageXpressMicro Confocal 系統(tǒng)的 10x，20x，或 40x的物鏡來(lái)進(jìn)行圖像拍攝。在焦點(diǎn)軸 ( Z 堆棧 ) 的不同平面上獲得一系列圖像 ( 圖 1 )。得到了 3 ~ 10 μm 厚度的 17-30 個(gè)面層，深度約 150 ~ 300 μm。所有單層的圖像都被保存并用于 3D 分析， 以及 2D 投影 ( Z大投影或Z佳聚焦 ) 圖像。

本次獲得的 2D Z大投影圖像分析
使用 Meta Xpress 高通量圖像采集和分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。這些圖像的自動(dòng)定量分析使用了兩種方法：投影圖像的分析 (2D) 或 Z 疊加后的 3D 圖像分析。為了對(duì)投影圖像進(jìn)行分析，在采集時(shí)將Z-Stack 圖像轉(zhuǎn)換為 2D 投影圖像，然后使用 MetaXpress Neurite Outgrowth 應(yīng)用模塊進(jìn)行分析。表型讀數(shù)包括通過(guò)幾個(gè)端點(diǎn)測(cè)量來(lái)定量表征神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的范圍和復(fù)雜性， 這些端點(diǎn)測(cè)量包括：總神經(jīng)突起生長(zhǎng)、過(guò)程和分支的數(shù)量，以及細(xì)胞數(shù)量和生存能力。本次得出的Z佳聚焦投影圖像用于透射光圖像的分析。投影圖像的分析是快速的，同時(shí)提供了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的生長(zhǎng)范圍的準(zhǔn)確估計(jì)。然而，二維分析有其局限性，因?yàn)檫@種方法無(wú)法進(jìn)行體積測(cè)量，并且通常只計(jì)算物體的一小部分。圖 2 和圖 3 顯示了對(duì)照組和魚(yú)藤酮處理的神經(jīng)元培養(yǎng)物的復(fù)合熒光圖像，這些神經(jīng)元培養(yǎng)物具有用于測(cè)量神經(jīng)突起生長(zhǎng)的“分析圖層”。測(cè)量結(jié)果包括總突起生長(zhǎng)，分支數(shù)，過(guò)程，總細(xì)胞數(shù) ( 細(xì)胞體 )。圖 4 顯示神經(jīng)突起生長(zhǎng)長(zhǎng)度、分支數(shù)目和細(xì)胞活力隨著接觸神經(jīng)毒性化合物而減少，這些化合物包括：三苯基磷酸酯、 四乙基硫脲、六氯苯基、魚(yú)藤酮和甲基汞 ( 每種 10 μM )。

圖2 神經(jīng)元活細(xì)胞染色。 iCell 神經(jīng)元細(xì)胞接種于 OrganoPlate 微孔板的基質(zhì)膠內(nèi)，每孔約 30,000 個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng) 5 天，然后用活性染料 Calcein AM、線粒體完整性染料 MitoTracker Orange 和Hoechst 核染料對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色。然后使用 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)，在共具焦模式下，使用 60μm 針孔旋轉(zhuǎn)盤結(jié)構(gòu)，DAPI、FITC 和 TRITC 通道，20 倍物鏡，以 6 μm 步徑拍攝 25 幅圖像，獲得了 3 色的 Z 疊加圖像。這里給出了本次實(shí)驗(yàn)中 DAPI 和 FITC 通道的Z大投影合成圖像。

圖 3 神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的 2D 分析。 iCell 神經(jīng)元以每片 30,000 個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng) 24 小時(shí)，然后用化合物處理 5 天，隨后用鈣調(diào)素 AM、MitoTracker Orange 和 Hoechst 染色活細(xì)胞。在共具焦模式下，使用ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)的 60 μm 針孔旋轉(zhuǎn)圓盤模式，在 20 倍物鏡下拍攝了 3 色的 Z 疊加圖像。以上得出的Z大投影圖像使用 MetaXpress 神經(jīng)突起生長(zhǎng)應(yīng)用模塊進(jìn)行分析。細(xì)胞體和突起的分析圖層用紅色標(biāo)識(shí)。圖像展示出了對(duì)照組圖像 (DMSO) 和魚(yú)藤酮 ( 10 毫米 ) 處理的細(xì)胞。作為復(fù)合治療的結(jié)果，神經(jīng)元連接的崩解是可以被檢測(cè)的。

3D 可視化和 3D 圖像分析
MetaXpress 軟件提供了 3D 分析選項(xiàng)，允許組合來(lái)自相鄰 Z 平面的對(duì)象，以及細(xì)胞和網(wǎng)絡(luò)的 3D 可視化。使用 3D 分析自定義模塊分析圖像，利用“查找纖維”功能生成用于定量神經(jīng)突起生長(zhǎng)的“纖維”測(cè)量；細(xì)胞核也可以用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。首先在每個(gè)平面中找到對(duì)象，然后使用“Z佳連接”函數(shù)在 3D 空間中進(jìn)行連接。3D 分析通常是密集處理型的，但是可以提高 3D 空間中物體 ( 包括多個(gè)重疊物體 ) 的分辨率和數(shù)量。從 3D 分析種輸出的測(cè)量結(jié)果包括神經(jīng)突 ( 纖維 ) 的數(shù)目、細(xì)胞體積、纖維總體積 、 突起數(shù)目和分支點(diǎn) 。 通過(guò)尋 找Hoechst 染色陽(yáng)性的“球形物體”來(lái)確定細(xì)胞總數(shù) ( 細(xì)胞核 )。圖 5A 顯示了“纖維”和“核”的分析圖層。另一個(gè)定制模塊用于表征細(xì)胞活力 ( CalceinAM 陽(yáng)性的細(xì)胞體 ) 和線粒體完整性 ( MitoTracker Orange陽(yáng)性的細(xì)胞體 ) 的測(cè)量。利用三維細(xì)胞評(píng)分分析對(duì)活細(xì)胞 ( CalceinAM 陽(yáng)性 ) 和線粒體完整細(xì)胞 ( MitoTracker陽(yáng)性細(xì)胞 ) 進(jìn)行計(jì)數(shù)和表征。通過(guò)該分析方法計(jì)算的結(jié)果包括：細(xì)胞數(shù) ( 總核 )、活細(xì)胞數(shù) ( 鈣調(diào)素 AM 陽(yáng)性 )、MitoTracker陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、以及細(xì)胞體積或熒光強(qiáng)度。圖 5B 和 5C 示出了“鈣黃綠素 AM 陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)”、“MitoTracker 陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)”和“細(xì)胞核”的分析圖層。圖 6 給出了幾種表征神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)復(fù)合效應(yīng)的測(cè)量值：突起 (“纖維”) 和分支點(diǎn)的數(shù)量以及具有完整線粒體的活細(xì)胞或細(xì)胞的數(shù)量的減少。

圖 4 特定化合物對(duì)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)影響性的 2D 分析。 iCell 神經(jīng)元如圖 2 所示進(jìn)行培養(yǎng)，并用所指示的神經(jīng)毒性化合物處理 5 天。在共聚焦模式下，使用 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)，使用 60 個(gè)旋轉(zhuǎn)盤模式、20 倍物鏡，拍攝了 3 色的 Z 疊加圖像。使用神經(jīng)突起生長(zhǎng)分析模塊對(duì)本次產(chǎn)生的Z大值投影圖像 ( 3D 系列圖像的 2D 投影 ) 進(jìn)行分析?；衔锏臐舛?(10 μM) 對(duì)總生長(zhǎng)量、活細(xì)胞數(shù)、分支數(shù)和突起數(shù)有定量影響

圖 5 神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的 3D 分析。 如圖 2 所示方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理和染色，。使用 MetaXpress 自定義模塊編輯器的 3D 分析選項(xiàng)分析 Z-stacks 圖像。用兩種不同的分析模塊來(lái)評(píng)估 3D 中神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜度：測(cè)量纖維 ( 神經(jīng)突起 ) 和陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分 ( 標(biāo)記表達(dá) )。 (A) 在自定義模塊編輯器 (CME) 中使用“查找纖維”和“通過(guò)Z佳匹配連接”選項(xiàng)，在 3D 空間中檢測(cè)和計(jì)數(shù)神經(jīng)突 ( 纖維 ) 的數(shù)量和體積以及節(jié)段和分支點(diǎn)。顯示了纖維 ( 綠色 ) 和核 ( 藍(lán)色 ) 的可視化。 (B) 應(yīng)用"細(xì)胞評(píng)分"和 CME 的“Z佳匹配”功能，在3D 空間測(cè)量總細(xì)胞數(shù)、鈣素 AM 陽(yáng)性“活”細(xì)胞和鈣素 AM 陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)體積。細(xì)胞核用藍(lán)色顯示，綠色為陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)。 (C) 在 CME 中使用“細(xì)胞評(píng)分”和“Z佳匹配連接”選項(xiàng)測(cè)量 MitoTracker 染色陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和 MitoTracker 染色陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)的體積；細(xì)胞核呈藍(lán)色顯示，線粒體呈紅色
使用 OrganoPlates 進(jìn)行 3D 神經(jīng)毒性分析
表型讀數(shù)包括通過(guò)多重測(cè)量定量表征神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在 3D 中的范圍和復(fù)雜性。在這個(gè)神經(jīng)元模型系統(tǒng)中，我們?cè)u(píng)估了試驗(yàn)的重復(fù)性，表征了多次測(cè)量，并測(cè)試了幾種已知的神經(jīng)毒性化合物。通過(guò)這些分析方法，我們精確地測(cè)量了這些化合物對(duì)神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的濃度依賴性抑制作用。因此，本文提出的方法可用于高通量、高含量化合物篩選并用于神經(jīng)毒性的預(yù)測(cè)。

結(jié)論
我們開(kāi)發(fā)了一種定量的、共聚焦的高通量成像方法，該方法能夠使用 MIMETASOrganoPlates 的神經(jīng)元培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行高通量表型評(píng)估，表征對(duì) 3D 神經(jīng)元的存活率和形態(tài)的影響。共具焦成像和多參數(shù) 3D 分析允許對(duì)神經(jīng)突進(jìn)行計(jì)數(shù)和表征，并且還提供了神經(jīng)突發(fā)育和分支在 3D 模型中的統(tǒng)計(jì)特征。該分析方法能夠?qū)ι窠?jīng)元網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行表征，并提供可用于確定 EC50 值和比較所選化合物的毒性效應(yīng)的定量測(cè)量。

圖 6 特定化合物對(duì)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)影響性的 3D 分析。 iCell 神經(jīng)元如圖 2 所示進(jìn)行培養(yǎng)，并用指示的神經(jīng)毒性化合物處理 5 天。10 μm 濃度在三維測(cè)量結(jié)果中有不同的測(cè)量值。在三維空間中檢測(cè)和計(jì)數(shù)神經(jīng)突起 ( 纖維 ) 和分支點(diǎn)的數(shù)量和體積。此外，還計(jì)數(shù)了細(xì)胞總數(shù)、鈣調(diào)素 AM 陽(yáng)性“活”細(xì)胞和 MitoTracker Orange 陽(yáng)性細(xì)胞，并用 3D 進(jìn)行表征。給出了化合物對(duì)神經(jīng)突 ( 纖維 ) 的數(shù)量和總體積、分支點(diǎn)數(shù)目、總數(shù)、活細(xì)胞和 MitoTracker Orange 陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量影響