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輔酶ⅠNAD(H)含量測定試劑盒說明書

本文由 上海索寶生物科技有限公司 整理匯編

2018-09-02 10:00 2561閱讀次數(shù)

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輔酶ⅠNAD(H)含量測定試劑盒說明書(50T)一、測定意義:NAD是糖酵解和TCA循環(huán)的主要氫受體,生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈傳遞把電子交給氧,在合成ATP的同時,形成大量的ROS,同時NADH再生為NAD。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD比值的高低可用于評價糖酵解和TCA循環(huán)的強弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD比值說明細胞呼吸耗氧量較高,處于過氧化狀態(tài),NADH/NAD比值升高也可YZ糖酵解和TCA循環(huán)。另外,NAD降解產(chǎn)物具有非常重要的調(diào)控作用。二、測定原理:NAD和NADH在254nm下有吸收峰,利用GX液相色譜法在相應(yīng)波長下測定其含量。三、試驗中需自備的儀器和試劑:GX液相色譜儀、低速離心機、溶劑抽濾裝置、針頭式過濾器(水系,50個,0.22μm)、濾膜(水系和有機系各2個,0.45μm)、C18柱(4.6×150mm)、可調(diào)式移液器、樣品瓶(50個,2mL)、乙腈(120mL)、甲醇(色譜級,300mL)、蒸餾水注:若用自動進樣器,需要樣品瓶,測定時將不少于1mL的樣品或標準品加入樣品瓶中。無自動進樣器,需手動進樣時,不需要樣品瓶,用進樣針將不少于20ul的樣品或標準品打入進樣閥。四、試劑的組成和配制:試劑一:粉劑1×1瓶,粉劑2×1瓶,4℃保存;臨用前用少量蒸餾水將粉劑1和粉劑2溶解后倒入容量瓶中,用蒸餾水定容至100mL,形成NAD和NADH提取液(注:試劑瓶中的粉劑要沖洗干凈),4℃保存3個月;試劑二:粉劑1×1瓶,粉劑2×1瓶,粉劑3×1瓶,4℃保存;臨用前用少量蒸餾水將粉劑1、粉劑2和粉劑3溶解后倒入容量瓶中,用蒸餾水定容至1000mL,形成流動相緩沖液基質(zhì)(注:試劑瓶中的粉劑要沖洗干凈),4℃保存3個月。試劑三:NAD標準品5mg×1支,-20℃保存。加入1mL試劑一,配成5mg/mL溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用,用不完的試劑-20℃保存。試劑四:NADH標準品5mg×1支,-20℃保存。加入1mL試劑一,配成5mg/mL溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用,用不完的試劑-20℃保存。五、實驗前的準備工作:1.將雙蒸水1000mL、流動相緩沖液基質(zhì)1000mL、甲醇300mL和乙腈120mL用0.45μm的濾膜抽濾,以除去溶劑中的雜質(zhì),防止堵塞色譜柱。(注:雙蒸水和緩沖液基質(zhì)用水系濾膜抽濾,乙腈用有機系濾膜抽濾)。2.流動相的配制:將抽濾完畢的流動相緩沖液基質(zhì)1000mL與乙腈配比為9:1(v/v),即取900mL緩沖液基質(zhì)與100mL乙腈混合。[每個樣品需要約12mL流動相,流動相用量(mL)=12mL×樣品數(shù)量+跑基線用量(約50mL),流動相的用量請根據(jù)樣品數(shù)量用多少配多少]。3.將抽濾完畢的甲醇和雙蒸水配比成1**%的甲醇,10%的甲醇,雙蒸水各250mL。4.將2和3中的溶劑超聲30分鐘,以脫去溶劑中的氣泡,防止堵塞色譜柱。六、輔酶ⅠNAD(H)的提取:組織的處理:準確稱取組織重量,按重量體積比(g/mL)加9倍試劑一,提取NAD和NADH,制成10%勻漿。20000g/min離心30min,取上清液用0.22μm水系針頭式過濾器過濾后待測,同時測定組織蛋白含量。細胞處理:收集于60mL細胞,離心菌體經(jīng)高壓冷凍干燥12h后,加入2mL試劑一。超聲破壁細胞(950W,30%,15min,工作1s,間隔2s),再經(jīng)10,000r4℃高速離心40s,上清用0.22μm水系微孔濾膜過濾后直接上柱檢測。七、輔酶ⅠNAD(H)含量測定操作步驟:1.開啟電腦、檢測器和泵,安裝上色譜柱,打開empower軟件,在方法組中設(shè)置進樣量20μL,流速0.8mL/min,保留時間15min,檢測波長254nm,設(shè)置完畢保存方法組。2.用1**%的甲醇、10%的甲醇、雙蒸水按甲醇濃度從大到小的順序洗色譜柱30min。3.用流動相洗柱子,待基線穩(wěn)定后開始加樣。4.加入標準品20μL,在15min內(nèi)可分離NAD和NADH,NAD的保留時間在3min左右,NADH的保留時間在7min左右(柱子不同,保留時間有差異),計算不同濃度的NAD和NADH標準品的峰面積。5.加入樣品20μL,在相應(yīng)保留時間處檢測NAD和NADH的峰面積。八、輔酶ⅠNAD(H)含量的計算:1.NAD含量的計算NAD標準曲線的繪制:將5mg/ml的NAD標準品用雙蒸水分別稀釋成110μg/ml、80μg/ml、50μg/ml、和20μg/ml的NAD標準品溶液,計算不同標準品溶液的峰面積。計算標準曲線公式為:y=25069χ-26754(χ為NAD濃度,μg/ml;y為峰面積)推出:χ=(y+26754)÷25069(χ為NAD濃度,μg/ml;y為峰面積)NAD含量(μg/mgprot)=(樣品峰面積+26754)÷25069÷CprotCprot為待測樣本蛋白濃度2.NADH含量的計算NADH標準曲線的繪制:將5mg/ml的NADH標準品用雙蒸水分別稀釋成200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml和50μg/ml的NADH標準品溶液,計算不同標準品溶液的峰面積。計算標準曲線公式為:y=13275χ+35717(χ為NADH濃度,μg/ml;y為峰面積)推出:χ=(y35717)÷13275(χ為NADH濃度,μg/ml;y為峰面積)NADH含量(μg/mgprot)=(樣品峰面積-35717)÷13275÷CprotCprot為待測樣本蛋白濃度注:標準品的稀釋倍數(shù)要根據(jù)樣品中NAD和NADH濃度確定,樣品中NAD和NADH的峰面積必須落在不同濃度的NAD和NADH標準品的峰面積之內(nèi),該標準曲線緊供參考。ShanghaisolarbioBioscience&TechnologyCo.,LTD上海索萊寶生物科技有限公司是一家集銷售生化試劑、實驗耗材、自產(chǎn)分子生物學產(chǎn)品為一體,并能提供技術(shù)支持的專業(yè)性生物科技公司。公司秉承“以客戶為ZX,以產(chǎn)品為保障、以誠信為基礎(chǔ)、以創(chuàng)新為宗旨”的發(fā)展理念,在依靠客戶的大力支持和員工的不懈努力下獲得了快速的成長。公司組織結(jié)構(gòu)清晰,內(nèi)部管理科學,擁有一支既分工細致又高度合作的年輕化隊伍,保持了各個部門之間的GX合作運轉(zhuǎn),充分保障了公司在充滿競爭的市場中處于領(lǐng)xian地位。公司注重與業(yè)界精英合作,目前公司已經(jīng)和Amersham、Amresco、Axygen、BD、Corning、Dragon、Eppendorf、企業(yè)結(jié)成緊密的合作伙伴關(guān)系,代理其領(lǐng)xian世界的產(chǎn)品,并在全國各地設(shè)有分銷機構(gòu)。我們將以高度的責任感和出色的產(chǎn)品質(zhì)量為客戶提供高品質(zhì)的產(chǎn)品和實驗技術(shù)解決方案。豐富的經(jīng)驗、優(yōu)良的品質(zhì)、充足的庫存、準確的交貨時間、極具競爭力的價格,所有這些都保證了我們向您提供的是Z專業(yè)Zyou質(zhì)的服務(wù)!立足北京,上海,輻射全國,隨著產(chǎn)品營銷戰(zhàn)略的不斷延伸,我們將逐步發(fā)展成為yi流的專業(yè)性生物科技公司。我們希望能夠和尊敬的客戶一起,利用各自的資源優(yōu)勢和勇于進取的敬業(yè)精神,為ZG生命科學研究的發(fā)展作出更多的貢獻。為了更好、更全面的發(fā)展,現(xiàn)公司正在誠招各地dai理商和招聘若干銷售、研發(fā)人員,歡迎垂詢并期待您的加入!輔酶ⅠNAD(H)含量測定試劑盒上海索寶特價【021-54100800】聯(lián)系方式上海索萊寶生物科技有限公司電話:021-6485566518018609966傳真:021-54261506郵編:200233地址:上海市欽江路15號14層郵箱:solarbio@126.com網(wǎng)址:www.shsolarbio.com優(yōu)質(zhì)試劑質(zhì)量放心價格Zdi為ZG生物產(chǎn)業(yè)做貢獻

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