国产三级在线看完整版-内射白嫩大屁股在线播放91-欧美精品国产精品综合-国产精品视频网站一区-一二三四在线观看视频韩国-国产不卡国产不卡国产精品不卡-日本岛国一区二区三区四区-成年人免费在线看片网站-熟女少妇一区二区三区四区

儀器網(wǎng)(yiqi.com)歡迎您!

| 注冊(cè)2 登錄
網(wǎng)站首頁-資訊-話題-產(chǎn)品-評(píng)測(cè)-品牌庫(kù)-供應(yīng)商-展會(huì)-招標(biāo)-采購(gòu)-知識(shí)-技術(shù)-社區(qū)-資料-方案-產(chǎn)品庫(kù)-視頻

資料庫(kù)

儀器網(wǎng)> 資料庫(kù)>ELISA的技術(shù)要點(diǎn)--試劑的制備

ELISA的技術(shù)要點(diǎn)--試劑的制備

本文由 上海盈公生物技術(shù)有限公司 整理匯編

2018-09-27 10:00 570閱讀次數(shù)

掃    碼    分   享
文檔僅可預(yù)覽首頁內(nèi)容,請(qǐng)下載后查看全文信息!
立即下載
ELISA的技術(shù)要點(diǎn)--試劑的制備試劑的制備  ELISA的主要試劑有固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物。以下分別介紹這些試劑的原料和制備方法?! 。ㄒ唬┕滔噍d體 檢測(cè)中可作ELISA中載體的物質(zhì)很多,Z常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯為塑料,可制成各種形式。在ELISA測(cè)定過程中,它作為載體和容器,不參與化學(xué)反應(yīng)。重要的是聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能,抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后依然保留原來的免疫活性。加之它的價(jià)格低廉,所以被普遍采用?! LISA載體的形狀主要有三種:小試管、小珠和微量反應(yīng)板。小試管的特點(diǎn)是兼作反應(yīng)的容器,Z后放入分光光度計(jì)中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球,表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器,在洗滌過程中使圓珠滾動(dòng)淋洗,效果更好。Z常用的載體為微量反應(yīng)板,專用于ELISA測(cè)定的產(chǎn)品也稱為ELISA試劑盒,國(guó)際通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測(cè),有制成8聯(lián)或12聯(lián)孔條的,放入座架后,大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA試劑盒的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè),并可在特定的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果。現(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量反應(yīng)板型的ELISA檢測(cè),包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟,對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化有重要意義?! ×己玫腅LISA試劑盒應(yīng)該是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別,各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號(hào)的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為:以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔后,每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗人IgG抗體,保溫后洗滌,加底物顯色,終止酶反應(yīng)后分別測(cè)每孔溶液的吸光度??刂品磻?yīng)條件,使各讀數(shù)在0.8左右。計(jì)算所有讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10%?! ∨c聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體,聚氯乙烯板的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄,可切割,價(jià)廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值有時(shí)也略高?! 楸容^不同固相在某一ELISA測(cè)定中的優(yōu)劣,可用以下方法加以檢驗(yàn):用其它免疫學(xué)測(cè)定方法選出一個(gè)典型的陽性標(biāo)本和一個(gè)典型的陰性標(biāo)本。將它們分別進(jìn)行一系列稀釋后,在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測(cè)定,然后比較測(cè)定結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果判別Zda,這種載體就是這一ELISA測(cè)定的Z合適的固相載體?! 〕芰现破吠猓滔嗝该庖邷y(cè)定的載體還有兩種材料:一是微孔濾膜,如硝酸纖維素膜、尼龍膜等。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的,反應(yīng)時(shí)固相微粒懸浮在溶液中,具有液相反應(yīng)的速率,反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸引作為分離的手段,洗滌也十分方便,但需配備特殊的儀器?! 。ǘ┛乖涂贵w  在ELISA實(shí)施過程中,抗原和抗體的質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵因素。本法要求所用抗原純度高,抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)?! LISA所用抗原有三個(gè)來源:天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于動(dòng)物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等,一般含有多種抗原成分,需經(jīng)純化,提取出特定的抗原成分后才可應(yīng)用,因此也稱提純抗原(purifiedantigen)。重組抗原(recombinantantigen)和多肽抗原(peptideantigen)均為人工合成品,使用安全,而且純度高,干擾物質(zhì)少。因此雖然制備合成抗原有較高的技術(shù)難度且要求較為昂貴的儀器設(shè)備和試劑,其應(yīng)用仍十分普遍,特別是對(duì)那些天然抗原不易得到的試驗(yàn),更顯出其獨(dú)到之處。  用于ELISA的抗體有多克隆的和單克隆的??寡宄煞謴?fù)雜,應(yīng)從中提取IgG才可用于包被固相或酶標(biāo)記。含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高,有時(shí)可適當(dāng)稀釋后直接進(jìn)行包被。制備酶結(jié)合物用的抗體的質(zhì)量往往要求有較高的純度。經(jīng)硫酸銨鹽析純化的IgG可進(jìn)一步用各種分子篩層析提純。也可用親和層析法提純特異性IgG,如用酶消化IgG后提取的Fab片段,則效果更好?! 。ㄈ┟庖呶絼 」滔嗟目乖蚩贵w稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被(coating)。由于載體的不同,包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體,通常將抗原或抗體溶于緩沖液(Z常用的為pH9.6的碳酸緩沖液)中,加于ELISA板孔中在4℃,經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低,固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)完全覆蓋,其后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會(huì)部分地吸附于固相載體表面,Z后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高。在這種情況下,如在包被后再用1%~5%牛血清白蛋白包被一次,可以消除這種干擾。這一過程稱為封閉(blocking)。包被好的ELISA試劑盒在低溫可放置一段時(shí)間而不失去其免疫活性?! 。ㄋ模┟负偷孜铩 LISA中所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價(jià)格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定,繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。**在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存,價(jià)格低廉,有色產(chǎn)物易于測(cè)定,光吸收高。ELISA中Z常用的酶為辣根過氧化酶(HRP)和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶(AP)。HRP在蔬菜作物辣根中含量很高,純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白,含糖量約18%;分子量為44kD;是一種復(fù)合酶,由主酶(酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅素)結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白,在275nm波長(zhǎng)處有Z高吸收峰;輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán).

參與評(píng)論

全部評(píng)論(0條)

更多資料

該會(huì)員其他資料
如何選擇抗體--抗體選擇指南
人軟骨糖蛋白39(HC gp-39)ELISA試劑盒說明書
薄荷腦說明書
新方法可快速廉價(jià)診斷肺結(jié)核
菸酸缺乏病的發(fā)病機(jī)理介紹
人β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)Elisa試劑盒注意事項(xiàng)說明
抗體催化的化學(xué)反應(yīng)及制備
關(guān)于水楊酸的美容效果介紹
甲氨蝶呤的作用介紹
抗體酶

在線留言

換一張?
取消