提取細(xì)菌蛋白質(zhì)
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設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)提取大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)盡可能多的蛋白質(zhì)，做核磁，要求盡可能不含蛋白質(zhì)外的雜質(zhì)，蛋白質(zhì)組盡量完整，不知有沒有什么方法，希望大家指點(diǎn)？目前試過雙水相萃取，但效果似乎不是很... 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)提取大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)盡可能多的蛋白質(zhì)，做核磁，要求盡可能不含蛋白質(zhì)外的雜質(zhì)，蛋白質(zhì)組盡量完整，不知有沒有什么方法，希望大家指點(diǎn)？ 目前試過雙水相萃取，但效果似乎不是很好 展開
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- ossiqief4 2009-04-16 00:00:00
- 微波萃取
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- 大兄弟借籃球 2009-04-22 00:00:00
- 1. 可以考慮超聲波破碎以后提取 2. 溶解酶直接破壁，然后提取 僅供參考
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- 誰是111我的 2009-04-28 00:00:00
- 細(xì)菌工程菌胞內(nèi)表達(dá)主要分為兩種形式，一種是在強(qiáng)啟動(dòng)子條件下的GX表達(dá)，由于蛋白的過度表達(dá)，使蛋白不能及時(shí)有效折疊而發(fā)生無規(guī)則卷曲，以固體顆粒的形式堆積于胞間質(zhì)中，這就是所說的包涵體，另外一種是間質(zhì)內(nèi)的可溶性表達(dá)，即可以發(fā)生正常折疊，具有生物活性。一般情況下，細(xì)菌只要被正常破壁就可以通過離心的形式將包涵體和可溶性表達(dá)的蛋白分離開。 超聲破碎的條件一般是300w，10s/10s，20分鐘，具體條件可根據(jù)自身情況而定。 超聲前菌體的準(zhǔn)備：菌液離心后，先用PBS將菌沉淀洗2-3遍，然后按原菌液體積的1/5-1/10加入裂解液重懸菌體，裂解液的成分：50mMTris-HCl， pH8.0， 2mM EDTA，100mM NaCl，加溶菌酶至100ug/ml，0.1%Triton X-100。切記冰浴超聲！ 如何判斷是否超聲完全：一般有以下幾個(gè)方面： 1，外觀判斷：超聲前菌懸液是渾濁的，超聲完全后變的透明、清澈。 2，液體的粘滯性：超聲后菌液從槍頭滴下不粘連。 3，高速離心：有用高速離心檢測(cè)超聲破碎程度的（一般用6，000 g 10 min， 比一般離心收集菌體的轉(zhuǎn)速高一點(diǎn)）。 沉淀是未破碎或破碎不完全的菌體。 4，染色：破碎后的菌液涂片，革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘，鏡檢。 超聲后加入核酸酶消除核酸對(duì)蛋白的污染。 一些需要注意的問題： 1，蛋白以包涵體形式表達(dá)，追求的是高破碎率，要求細(xì)胞碎片很小，而另一種蛋白是可溶形式表達(dá)，所以細(xì)胞碎片不能很小，兩種情況要求不同但目的相同，都是便于后期的固液分離。 2，如果超聲時(shí)出現(xiàn)黑色沉淀，說明超聲功率太強(qiáng)。 3，超聲時(shí)間太長、功率太高對(duì)蛋白活性肯定有影響。 4，盡量防止泡沫的產(chǎn)生。
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