用CTAB法提取細(xì)菌DNA的過程

阿飛lufei 2017-10-08 08:45:39 670 瀏覽

或者對(duì)于細(xì)胞壁比較厚的革蘭氏陽性菌有沒有不用提DNA就能PCR的方法... 或者對(duì)于細(xì)胞壁比較厚的革蘭氏陽性菌有沒有不用提DNA就能PCR的方法展開

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heitiansh1 2017-10-09 00:00:00

一、針對(duì)一些不易于提取的細(xì)菌的方法: 試驗(yàn)試劑：抽提緩沖液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素） 100mMTris-HCl(pH8.0) 25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MLiCl 2MLiCl DEPC-water（YZRNA酶活性） 3MNaAc(pH5.2) 96%乙醇 70%乙醇試驗(yàn)步驟： 1、抽提緩沖液65℃預(yù)熱。 2、加菌體到已經(jīng)預(yù)熱的緩沖液（700ul）中混勻，65℃，10min。 3、加酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振蕩，以12000rpm，離心10min。 4、取上清，加氯仿/異戊醇（24：1）振蕩，以12000rpm，離心10min。 5、重復(fù)再作一次步驟4。 6、加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），－20C下沉淀。 7、以2000rpm，離心10min。 8、棄上清，以70％乙醇條洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于 100ml 水中。二、較為常用的細(xì)菌DNA提取方法：實(shí)驗(yàn)步驟： 1、將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。 2、取1.5ml 培養(yǎng)物12000rpm離心2min。 3、沉淀中加入567ul 的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入 30ul10%SDS和15ul 的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h. 4、加入100ul5mol/LNaCl 充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl 溶液，混勻后再65℃溫育10min。 5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。 6、沉淀用1ml 的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇．三、菌液直接PCR 菌液直接PCR只需要用槍頭沾取菌落，或者加入1-2微升菌液即可。預(yù)變性時(shí)間可稍微延長(zhǎng)。如果引物特異性好，效果與用DNA模板差不多。

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