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  大大拿0 2017-01-03 00:00:00

  細菌基因組DNA的提取方法綜述，提供了五種方法。 一、快速微量提取法 A.取1.5ml菌體培養(yǎng)物于一滅菌Ep管中，12000rpm離心1min， 丟去上清夜，收集菌體。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉，1mMEDTA，1%SDS，pH7.8）混勻，置于37oC水浴1hr。 C.然后加入200ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000rpm離心15min。 D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。 E.加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3M ，pH8.0)，-20度保存1小時后，13000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存?zhèn)溆谩? 二、蛋白酶/SDS法制備 先用10ml含適當(dāng)抗生素的GBM過夜培養(yǎng)Delftia sp.，第二天4000rpm離心10min收集菌體，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0，10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌體2次，之后將菌體充分懸浮在5ml 1×TE緩沖液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，輕輕混勻后50℃放置3h~5h，接著用等體積的Tris飽和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自動移液器吸管頭將絮狀DNA沉淀塊吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于適當(dāng)1×TE或ddH2O中。 三、 1) 細菌培養(yǎng)：細菌接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37℃搖床（300rpm）培養(yǎng)過液。 2) 細菌收集：取1ml培養(yǎng)物于1.5ml EP管中，室溫8000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。 3) 菌體裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃過夜。（此時菌液應(yīng)為透明粘稠液體） 4) 抽提：菌液均分到兩個1.5ml EP管，加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，室溫放置5-10min。12000rpm離心10min。抽提兩次。（上清很粘稠，吸取時應(yīng)小心，Z好槍頭尖應(yīng)剪去） 5) 沉淀：加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min。1 2000rpm離心10min。 6)洗滌：沉淀用75%的乙醇洗滌。 7) 抽（涼）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl電泳。作PCR模板用。 四、DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL 1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium. 2) Pellet cells by centrifugation， and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0)， 50 mM EDTA. 3) Freeze cell suspension at -20C 4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0)， 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension， and let thaw at room temperature. When thawed， place on ice for 45 min. 5) Add 1 ml 0.5% SDS， 50 mM Tris (pH 7.5)， 0.4 M EDTA， 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min. 6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10，000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary. 7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently)， then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting). Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5)， 1 mM EDTA， 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C. 8) Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10，000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube. 9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently)， then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting). 10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5)， 1 mM EDTA. 11) Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis. 五、 1) 100ml 細菌過夜培養(yǎng)液， 5000rpm離心10分鐘， 去上清液。 2) 加9.5ml TE懸浮沉淀， 并加0.5ml 10% SDS， 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K， 混勻， 37℃保溫1小時。 3) 加1.5ml 5mol/L NaCl， 混勻。 4) 加1.5ml CTAB/NaCl溶液， 混勻， 65℃保溫20分鐘。 5) 用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提， 5000rpm離心10分鐘， 將上清液移至干凈離心管。 6) 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提， 取上清液移至干凈管中。 7) 加1倍體積異丙醇， 顛倒混合， 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。 8) 用玻棒撈出DNA沉淀， 70%乙醇漂洗后， 吸干，溶解于1ml TE， -20℃保存。如DNA沉淀無法撈出，可5000rpm離心， 使DNA沉淀。 9) 如要除去其中的RNA， 可以按本章第三節(jié)中操作步驟處理。 注：1)CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2O，緩慢加入10g CTAB，加水至100ml。 　　2)氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)，5mol/L NaCl。 本方法通過SDS裂解細胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分一：儀器：同方法一 二：試劑：TE、TAE緩沖液；10%SDS；5MNaCL；20mg/ml蛋白酶K；CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中，緩慢加入10gCTAB，加熱溶解)；25/24/1，酚/氯仿/異戊醇; 24/1，氯仿/異戊醇；異丙醇；70％及乙醇三：操作 1.5ml 對數(shù)生長期細菌細胞 離心，5000rpm，1min 沉淀 溶于500μl TE緩沖液中混勻 30μl 10%SDS，3μL蛋白酶K，混勻，37℃，1小時 100μl NaCL(5M) 混勻 80μl的CTAB/NaCL，*混勻；65℃ 10min（可不做） 加入等體積酚/氯仿/異戊醇混合液，混勻，離心12000rpm，4-5min 取上清，以下操作與方法一中有機溶劑抽提、沉淀、干燥、除RNA 、復(fù)溶等步驟一致。注意 1，*此步操作后，離心管中NaCL的濃度不應(yīng)低于0.5M，否則DNA將與CTAB共沉淀。 2，本法適用于從多糖含量高的樣品中提取DNA。對于菌體樣品，通過此流程，可以獲得較為完整的DNA分子。

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