參與評論

評論

登錄后參與評論

全部評論(1條)

• 

  梅眉辣擠誘犢 2017-03-30 00:00:00

  細(xì)菌DNA提取方案：革蘭氏陰性菌，如E.coli，一般有三種可以選擇的方法。一、水煮模板法——主要用于PCR反應(yīng)1、接種單菌落于LB或腦心平板，連續(xù)畫線，37攝氏度培養(yǎng)18－24小時。2、刮取1～2接種環(huán)菌苔加入150微升三蒸水中，混勻，100攝氏度煮沸10分鐘。3、12000轉(zhuǎn)/分鐘 離心10分鐘，取上清，－20攝氏度保存?zhèn)溆?。操作Z簡便，對試劑條件要求低。缺點是純度不夠高，可能會含有RNA、蛋白等雜質(zhì)。但是作為一般檢測目的的PCR反應(yīng)模板已經(jīng)足夠了。有人稱擴增4kb以下片段都可用此種方法制取模版，編者用此類模板PCR可以擴增到3500bp的片段。建議：此法得到的模版保存時間短，強烈建議每月重新制作一次。二、CTAB/NaCl 法1、接種一單菌落于5mlLB中，30℃培養(yǎng)過夜，2、取1ml種子培養(yǎng)液接入100ml2%LB中，37℃、220r/min培養(yǎng)16小時;3、5000r/min離心10分鐘，棄去上清。4、加入10mlTE離心洗滌后，用10mlTE溶解菌體，混勻，-20℃保存?zhèn)溆谩?、取3.5ml菌懸液，加入184μl10%SDS，混勻，加入37μl10mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃溫育1小時6、加入740μl5mol/LNaCl，再加入512μlCTAB/NaCl，混勻，65℃溫育10分鐘。7、加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，10000r/min離心5分鐘，保留上清。8、上清中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，10000r/min離心5分鐘，保留上清。9、加入0.6倍的異丙醇，混勻，10000r/min離心5分鐘，收集DNA沉淀，用70%乙醇離心洗滌DNA沉淀。10、用1mlTE溶解DNA，加入終濃度為20μg/mlRNaseA，4℃保存。CTAB/NaCl法提取的DNA純度較高，蛋白雜質(zhì)較少，保存時間長，編者更喜歡把終濃度為20μg/ml RnaseA加在第5步溫育的時候，這樣Z后沒有RnaseA污染。每一步操作細(xì)致一些，得到的DNA可用于Southern blot。 建議：長時間保存DNA可放于-20℃，但要盡量減少反復(fù)凍融，否則影響DNA質(zhì)量。三、鹽析法‍1、1.5ml對數(shù)期菌液2、12000rpm 30 s3、200ul裂解液（同CTAB/NaCl法），37c，1hr4、66ul 5M NaCL，混勻充分，12000rpm 10min5、上清用粗槍頭取至新管6、等體積酚充分混勻，12000rpm 3min，反復(fù)抽提至無蛋白層7、取水層，等體積氯仿混勻，12000rpm 3min8、上清至新管，2倍體積預(yù)冷無水乙醇9、-20C，20min，14000rpm， 15min10、400ul 70%冷乙醇洗滌11、干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min12、2倍體積無水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗滌13、干燥，溶于100ul TE介于方法一和方法二之間，CTAB雖然取出糖分效果較好，但CTAB本身也是有毒的，所以此方法放棄了CTAB。革蘭氏陽性菌，由于細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與陰性菌有差別，裂解比陰性菌稍微麻煩一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修改，在第四步加入終濃度2mg/ml的溶菌酶，37度溫育1h。實驗注意：提基因組Z好要將槍頭尖剪掉（剪掉以后在酒精燈上迅速過一下，使其斷口圓滑）。以免槍頭損傷基因組！抽干時Z好是風(fēng)干！（轉(zhuǎn)載，僅供參考）

  贊(9)

  回復(fù)(0)

  評論

  評論

  登錄后參與評論