復(fù)合模式層析
MultiModal Chromatography, MM
是一種集合多種類型的相互作用（如離子交換、疏水等）于一體的層析模式，一種層析介質(zhì)即可發(fā)揮多選擇性和高分辨率的性能，真可謂“小身材有大威力”！
本次課堂，我們一起來看看，讓我們又愛又恨的復(fù)合模式層析填料！如何利用“套路”，篩選出最合適的復(fù)合模式層析填料并發(fā)揮最佳性能，進(jìn)階蛋白純化新技能。
圖1：復(fù)合模式層析配基類型示意圖
復(fù)合模式層析填料
目前共有四類復(fù)合模式層析填料：
Capto adhere Capto adhere ImpRes | 集合疏水等作用的陰離子交換復(fù)合模式 |
Capto MMC Capto MMC ImpRes | 集合疏水等作用的陽離子交換復(fù)合模式 |
Capto Core 400 | 集合疏水、凝膠過濾和離子交換復(fù)合模式 |
Capto Core 700 | 集合疏水、凝膠過濾和離子交換復(fù)合模式 |
Capto adhere & Capto adhere ImpRes
集合復(fù)合模式的陰離子交換填料，其配基上除了帶有正電荷外還具有氫鍵和疏水作用，可同時(shí)去除聚集體、DNA、病毒、脫落的Protein A配基等雜質(zhì)。
Capto adhere | Capto adhere ImpRes | |
平均粒徑 (μm) | 75 | 36-55 |
耐壓 (MPa) | 0.3 | 0.3 |
pH穩(wěn)定性 | 3-12 | 3-12 |
應(yīng)用/特性 | 多位點(diǎn)，用作抗體穿透，一步吸附HCP、DNA等雜質(zhì) | 高流速，高分辨率 |
Capto MMC & Capto MMC ImpRes
集合復(fù)合模式的陽離子交換填料，其配基上除了帶有負(fù)電荷外還具有氫鍵、疏水作用和嗜硫作用。這賦予其對(duì)高鹽溶液的良好耐受性和選擇性。
Capto MMC | Capto MMC ImpRes | |
平均粒徑 (μm) | 75 | 36-55 |
耐壓 (MPa) | 0.3 | 0.3 |
pH穩(wěn)定性 | 3-12 | 3-12 |
應(yīng)用/特性 | 耐受高鹽上樣 | 高流速，高分辨率 |
Capto Core 400 & Capto Core 700
Capto Core是一種具有獨(dú)特雙層結(jié)構(gòu)的多模式填料。其外層是5 μm的鈍化層，屏蔽了所有的結(jié)合位點(diǎn)并精準(zhǔn)控制孔徑。其內(nèi)層是多模式配基辛胺基，可吸附進(jìn)入內(nèi)部的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)。
圖2：Capto Core填料示意圖
Capto Core 400 | Capto Core 700 | |
平均粒徑 (μm) | 90 | 85 |
耐壓 (MPa) | 0.2 | 0.3 |
pH穩(wěn)定性 | 3-13 | 3-13 |
截留分子量 | >400 kDa | >700 kDa |
應(yīng)用分享
HTS and optimization of a multimodal polishing step in a MAb purification process using Capto adhere.
在抗體的復(fù)合模式精純步驟中使用Capto adhere實(shí)現(xiàn)高通量篩選和優(yōu)化。
本應(yīng)用描述了使用Capto adhere和MabSelect SuRe層析填料，通過高效的兩步法顯著降低樣品中IgG抗體聚集體的水平。
該方法實(shí)現(xiàn)了高得率和高純度；
采用篩選形式，利用PreDictor 96孔濾板、HiScreen預(yù)裝柱和DoE方法的卓越能力，能夠有效且快速地篩選出最佳實(shí)驗(yàn)條件；
優(yōu)化后的方案在單步操作中將聚集體水平從12.6%降低到<0.5%，單體得率為87%。HCP和配體泄漏減少到可忽略的水平；
總共篩選了192種條件（流穿和選擇性洗脫實(shí)驗(yàn)），大約在4小時(shí)內(nèi)完成篩選，并在48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分析。
材料和方法
初始條件篩選：
96孔純化預(yù)裝板的各孔道參數(shù)如圖（圖3），加入相應(yīng)樣品和緩沖液。
圖3：96孔預(yù)裝板的初始篩選實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)示意圖
流穿實(shí)驗(yàn)：
根據(jù)初始條件測(cè)試實(shí)驗(yàn)確認(rèn)上樣濃度為5.3 mg/mL，根據(jù)不同的pH和鹽濃度，進(jìn)行加樣測(cè)試（見圖4）。
圖4：96孔預(yù)裝板的流穿實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)示意圖
洗脫優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：
按洗脫參數(shù)示意圖（見圖5），驗(yàn)證不同洗脫條件的純化效果。
圖5：96孔預(yù)裝板的洗脫實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)示意圖
結(jié)果與討論
初始條件篩選：
圖6：96孔預(yù)裝板的初始篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果：A. 單體；B. 聚集體
初步篩選階段的目標(biāo)之一是確定所有組分達(dá)到平衡所需的孵育時(shí)間，以便估算單體和聚集體的結(jié)合特性。單體和聚集體的吸附分別在大約10分鐘和30分鐘后完成。由于聚集體的動(dòng)力學(xué)慢，為了確保完全結(jié)合，剩余實(shí)驗(yàn)選擇了60分鐘的孵育時(shí)間。
流穿實(shí)驗(yàn)：
圖7：96孔預(yù)裝板的流穿實(shí)驗(yàn)結(jié)果：A. 單體；B. 聚集體
實(shí)驗(yàn)采用的是含有14%聚集體的IgG樣品。在上樣后，流穿的部分用凝膠過濾層析方法進(jìn)行分析，計(jì)算單體和聚集體的含量。在所有的測(cè)試條件下，IgG單體的含量都超過聚集體的含量，意味著去除聚集體將不可避免地導(dǎo)致一些單體IgG的損失。
洗脫優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：
圖8.1：96孔預(yù)裝板的洗脫優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：A. 單體；B. 聚集體
IgG單體峰面積最大值出現(xiàn)在最低pH值6.0和250-300 mM NaCl濃度下，在該洗脫條件下，幾乎不含IgG聚體。
圖8.2：NaCl濃度和緩沖液pH對(duì)目的蛋白純度-得率的影響熱力圖
還原原始數(shù)據(jù)繪制熱力圖，用于優(yōu)化所有洗脫條件下的得率和純度。在這樣的熱力圖中，最佳點(diǎn)預(yù)計(jì)能同時(shí)產(chǎn)生最高的純度和得率。對(duì)照查詢可得峰值出現(xiàn)在大約pH 6.0和250 mM NaCl。
總 結(jié)
復(fù)合模式填料，由于其自身具有的多重層析性能，因此尤為適合在DoE這類實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行工藝參數(shù)的篩選和優(yōu)化操作。配合多種層析產(chǎn)品形式，無論是高通量的96孔層析板，亦或是HiScreen的工藝開發(fā)柱，都能以最高的效率助力工藝開發(fā)。
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