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文獻(xiàn)速遞丨MabSelect VL用于雙抗/三抗純化及兩步法工藝

來源：Cytiva（思拓凡）更新時(shí)間：2026-04-13 18:15:32 閱讀量：48

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2026年3月，WuXi Biologics的Lv等最新發(fā)表文章 “The superiority of MabSelect VL, Cytiva’s second-generation Protein L resin, over three other affinity resins in purifying a VHH-containing trispecific antibody”，探究Cytiva新一代片段親和填料MabSelect VL高效去除某三抗的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，再次將MabSelect VL用于復(fù)雜多抗的捕獲推向臺(tái)前^【1】。

圖1：2026年WuXi biologics DSPD發(fā)表文章：Cytiva第二代 Protein L填料 MabSelect VL在純化含VHH的三特異性抗體方面優(yōu)于其它3種親和填料（翻譯）

上一期，我們?yōu)榇蠹医庾x了Protein L的親和原理、影響因素，用于雙抗副產(chǎn)物雜質(zhì)去除的機(jī)理研究及經(jīng)典案例。

相關(guān)閱讀：

MabSelect VL之于雙抗純化的機(jī)理淺析

以Cytiva MabSelect VL為代表的Protein L片段親和填料，對(duì)于雙抗等復(fù)雜抗體的副產(chǎn)物雜質(zhì)去除主要基于親和力（Avidity，與兩側(cè)的親本抗體序列及結(jié)構(gòu)有關(guān)）和結(jié)合價(jià)（Valency）的差異，并注意考慮分子量大小的影響^【2-4】。例如對(duì)于半抗，樣品在Protein L上的洗脫保留時(shí)間取決于“（所有位點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)度總和）/分子量”的比值，其中“結(jié)合強(qiáng)度總和”由單一位點(diǎn)的“結(jié)合強(qiáng)度”和“結(jié)合位點(diǎn)個(gè)數(shù)”共同決定^【5】。

本期，小編將繼續(xù)為大家解讀MabSelect VL用于雙抗/三抗純化的最新文獻(xiàn)及兩步法工藝。

MabSelect VL用于非對(duì)稱型三抗純化

前述WuXi Biologics最新發(fā)表的文獻(xiàn)中（圖1），將MabSelect VL的應(yīng)用進(jìn)一步拓展至非對(duì)稱型三抗分子，樣品為某含VHH三抗，具有KiH設(shè)計(jì)以促進(jìn)重鏈異源二聚化，Knob一側(cè)為常規(guī)半抗結(jié)構(gòu)，Hole一側(cè)含兩個(gè)串聯(lián)的VHH，如圖2【1】。

圖2：某含VHH三抗分子及四種主要副產(chǎn)物雜質(zhì)（knob半抗、hole-hole homodimer、knob-knob homodimer、二聚/多聚集）

樣品先使用經(jīng)典的Protein A親和填料（非Cytiva品牌）進(jìn)行捕獲，只有一個(gè)洗脫峰（如圖3中A），且SEC-HPLC單體純度僅92.2%。參考Protein A親和捕獲洗脫組分的SEC-HPLC結(jié)果以及非還原SDS-PAGE膠圖，產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)主要有：knob半抗、hole-hole homodimer、knob-knob homodimer以及聚集體，從結(jié)構(gòu)上，目的三抗和雜質(zhì)分子在輕鏈可變區(qū)VL、輕鏈恒定區(qū)CL以及CH1的數(shù)量上存在差異。因此，作者篩選了結(jié)合kappa 1/3/4型輕鏈可變區(qū)的Cytiva MabSelect VL填料、結(jié)合kappa輕鏈恒定區(qū)的Cytiva KappaSelect填料以及某結(jié)合重鏈CH1親和填料，并以前述某Protein A親和填料作為對(duì)照。

三種片段親和填料，對(duì)目的三抗及雜質(zhì)分子具有相似的結(jié)合價(jià)，如表1?；谇捌赪uXi Biologics等的研究發(fā)現(xiàn)，MabSelect VL和CH1兩款片段親和填料對(duì)于不同單抗分子可以體現(xiàn)出不同的親和力，因此當(dāng)多抗來源的兩側(cè)親本抗體（相當(dāng)于homodimer）與填料的親和力存在明顯差異時(shí)，更利于非對(duì)稱型雙抗中 homodimer和半抗的去除；而KappaSelect對(duì)于不同抗體序列則難以體現(xiàn)出親和力差異，Protein A（尤其僅結(jié)合Fc類型）通常也不具備該特性^【5-6】。

參考Ingavat等^【7】文獻(xiàn)中的方法，將三款填料的結(jié)合價(jià)以及測(cè)試結(jié)果進(jìn)行匯總分析，如表1。

表1：某含VHH三抗與3種不同片段親和填料的結(jié)合價(jià)分析以及測(cè)試結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三款片段親和填料去除副產(chǎn)物雜質(zhì)的能力均優(yōu)于Protein A，且以Cytiva新一代MabSelect VL填料效果最佳（most effective medium），出現(xiàn)多個(gè)洗脫峰（如圖3中D），有效去除半抗、homodimer，尤其在去除聚集體方面更勝一籌，如圖3和表1。

圖3：使用4種不同的親和填料平行純化某澄清后的含VHH三抗分子。圖A為某Protein A親和填料、圖B為某CH1親和填料、圖C為KappaSelect、圖D為MabSelect VL。柱體積2-5 mL，KappaSelect的上樣量為5 mg/mL填料，其余均為30 mg/mL填料，RT=5 min。經(jīng)平衡buffer以及高鹽、低pH淋洗后，Wash 3為30 mM NaAc-Hac（pH 5.5）。全部拉pH線性梯度洗脫，某Protein A親和填料及MabSelect VL填料的洗脫終點(diǎn)為30 mM NaAc-Hac（pH 3.2），某CH1親和填料及KappaSelect的洗脫終點(diǎn)為120 mM Hac（pH 2.9），全部拉20 CV。Inset: 非還原SDS-PAGE膠圖片，M：蛋白marker；L：起始樣品；FT：穿透；Lanes 1–3/4：分別為洗脫收集組分1–3/4。

后續(xù)，作者繼續(xù)將MabSelect VL親和層析優(yōu)化為一步step梯度（30 mM NaAc-HAc, pH 4.8）洗脫目的樣品，HPLC-SEC顯示聚集體降低至2.8%（Protein A親和后為5.4%），單體96.3%-97.2%。不結(jié)合的hole-hole homodimer直接穿透，結(jié)合更強(qiáng)的knob半抗、knob-knob homodimer以及聚集體則出現(xiàn)在strip峰中。樣品和雜質(zhì)的洗脫強(qiáng)度與拉線性梯度時(shí)保持一致，再次印證了MabSelect VL強(qiáng)大的副產(chǎn)物雜質(zhì)去除能力。

三步變兩步：

基于MebSelect VL的兩步法雙抗純化工藝

在親和捕獲之后，完整的雙抗/三抗純化工藝還需要精純步驟進(jìn)一步去除剩余產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)及工藝相關(guān)雜質(zhì)，典型工藝為抗體純化三步法。MabSelect VL在捕獲階段即表現(xiàn)出強(qiáng)大的副產(chǎn)物雜質(zhì)去除能力，減輕了精純步驟壓力，使得兩步法工藝的開發(fā)更加易行。

2020年，Chen等就在摸索三種添加劑（NaCl、CaCl2和精氨酸）效應(yīng)的同時(shí)，開發(fā)了Protein L和Cytiva Capto adhere兩步法純化Blinatumomab （一種雙特異性T細(xì)胞連接器BiTE，為scFv串聯(lián)雙抗）的工藝策略^【8】。2024年底，WuXi Biologics的Dong等發(fā)表文章，基于新上市的MabSelect VL強(qiáng)大特性，分別針對(duì)對(duì)稱型（bsAb A，主要雜質(zhì)為聚集體）及非對(duì)稱型雙抗（bsAb B，雜質(zhì)含半抗、homodimer、3/4抗體以及聚集體）開發(fā)兩步法純化工藝，結(jié)果和基于Protein A的經(jīng)典三步法工藝質(zhì)量屬性相當(dāng)，從而節(jié)省了工藝時(shí)間和成本，且步驟少收率更高^【9】。

對(duì)稱型雙抗分子兩步法純化工藝開發(fā)

某對(duì)稱型雙抗分子bsAb A，主要雜質(zhì)為聚集體（含量23.3%，SEC-HPLC）。基于Protein L的片段親和捕獲法，在之前的諸多報(bào)道中均被證明可以有效去除雙抗聚集體，且加鹽添加劑效果更佳^【8，10】。類似地，作者在MabSelect VL親和捕獲過程中，通過向step梯度洗脫液中加入少量硫酸銨（篩選4/5/6 mM濃度），進(jìn)一步提高了聚集體的去除效果，得到的單體純度范圍在89.8–91.9%之間（SEC-HPLC），與Protein A親和洗脫的單體純度（79.8%）相比有顯著提高，如表2。這可能是由于硫酸銨對(duì)于多結(jié)合價(jià)態(tài)的聚集體的結(jié)合促進(jìn)作用比單體更強(qiáng)，放大了二者的親和力差異。但是，更高濃度的硫酸銨提高純度的同時(shí)也會(huì)損失部分收率，最終作者選擇了折中的5 mM硫酸銨并最終成功放大到106 mL，單體純度92%。

表2：針對(duì)MabSelect VL Wash 2及elution buffer中硫酸銨濃度進(jìn)行優(yōu)化，分別添加4/5/6 mM 硫酸銨，即對(duì)應(yīng)洗脫buffer為20 mM NaOAc?HOAc，4/5/6 mM (NH4)2SO4，pH 3.4。上樣量30 mg/mL填料。

剩余8%的聚集體以及其它工藝相關(guān)雜質(zhì)還需要精純進(jìn)一步去除。Cytiva復(fù)合模式填料Capto adhere（ImpRes）可以通過流穿模式有效去除聚集體，因兼具離子、疏水和氫鍵作用，比普通陰離子效果更勝一籌，且耐受鹽濃度也更高，因此常用于開發(fā)雙抗精純工藝^【11-15】。

文中WuXi Biologics以高通量的自制96孔板搭配自動(dòng)化移液工作站篩選不同的load pH（5/6/7/8）及l(fā)oad 電導(dǎo)（0/125/250 mM NaCl）對(duì)收率（確保目的樣品充分穿透）及純度的影響。類似的96孔篩選板，可以通過購買Cytiva用于蛋白質(zhì)純化的AcroPrep Advance 96孔濾板（推薦低蛋白吸附PES材質(zhì)Supor濾膜）以及散裝填料DIY自制^【16-17】，或直接購買預(yù)先填充填料的PreDictor 96孔板；可以離心操作、使用真空抽濾裝置或搭配自動(dòng)化移液工作站。

圖4：Cytiva AcroPrep Advance 96 孔濾板^【16】

結(jié)果如表3所示，對(duì)于Capto Adhere ImpRes，高pH和高電導(dǎo)的上樣條件更利于去除聚集體，但同時(shí)收率也隨之降低。最終選擇折中的50 mM NaOAc-HOAc, 250 mM NaCl（pH 6.0）進(jìn)行平衡和Wash。使用5.4 mL小柱再次驗(yàn)證，同時(shí)測(cè)試兩種上樣量50 mg/mL以及100 mg/mL填料（RT=5 min），SEC-HPLC結(jié)果顯示單體純度分別高達(dá)99.1% （收率73.8%）和98.6%（收率82.7%），有效去除了聚集體。成功開發(fā)兩步法工藝。

表3：使用 96孔板篩選Capto adhere ImpRes精純步驟的上樣條件。樣品為MabSelect VL洗脫對(duì)稱型雙抗分子A（單體純度92%），分別篩選loading pH和電導(dǎo)條件。

非對(duì)稱型雙抗分子兩步法純化工藝開發(fā)

對(duì)于非對(duì)稱型的雙抗分子bsAb B，則具有更復(fù)雜的副產(chǎn)物雜質(zhì)譜，包括典型的半抗、homodimer、3/4抗體以及聚集體。 經(jīng)過Protein A親和后，單體純度僅88.2%（SEC-HPLC）~85%（非還原Caliper毛細(xì)管電泳）。而前期研究中，Protein L對(duì)于這幾類副產(chǎn)物雜質(zhì)均有分離效果^【2】。

圖5. 非對(duì)稱型IgG樣雙抗及典型產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)示意圖^【2】

結(jié)果如圖6所示，在拉pH 5-3線性梯度洗脫的過程中，結(jié)合更弱的半抗、knob-knob homodimer（親本結(jié)合更弱）以及3/4抗體出現(xiàn)在低pH淋洗（W）組分中，hole-hole homodimer（親本結(jié)合更強(qiáng)）以及聚集體則在洗脫峰尾段（收集組分3）出現(xiàn)。并據(jù)此優(yōu)化為step梯度洗脫（pH 3.9），同時(shí)在wash buffer（pH 4.8）中加入0.2 M辛酸鈉進(jìn)一步促進(jìn)HCP去除，成功放大到106 mL。樣品純度提高至95.2%（SEC-HPLC）~ 98.1%（Caliper）。

圖6. MabSelect VL用于捕獲非對(duì)稱型雙抗bsAb B。柱體積2.9 mL，上樣量40 mg/mL填料，RT=5 min。中間低pH淋洗（W）條件：50 mM NaOAc?HOAc，5 mM NaCl，pH 5.0。洗脫buffer A：50 mM NaOAc?HOAc，5 mM NaCl（pH 5.0），洗脫buffer B：50 mM NaOAc?HOAc，25 mM NaCl（pH 3.0）拉20 CV。Inset: 非還原SDS-PAGE膠圖，M：蛋白marker；L：起始樣品；W：wash；1、2、3為洗脫收集組分，HH和KK分別為hole-hole及knob-knob homodimer標(biāo)準(zhǔn)品。

在精純步驟選擇陽離子交換層析，因其對(duì)該樣品的HCP去除效果優(yōu)于陰離子交換。拉NaCl線性梯度洗脫，將單體純度繼續(xù)提升至~99%。但作者也提示在缺少陰離子步驟的情況下，需要進(jìn)一步驗(yàn)證整體工藝的病毒等雜質(zhì)去除效果是否達(dá)到法規(guī)要求，并進(jìn)行優(yōu)化^【18】。

圖7. 針對(duì)對(duì)稱型以及非對(duì)稱型雙抗分子，使用MabSelect VL開發(fā)兩步法工藝及優(yōu)化策略^【9】。針對(duì)非對(duì)稱型雙抗也有文獻(xiàn)報(bào)道使用Capto Adhere 等復(fù)合模式填料^【8】。

以上兩個(gè)案例中，通過MabSelect VL捕獲階段的開發(fā)和優(yōu)化，在一步親和后即達(dá)到較高的單體純度（92-95%），成功建立了基于片段親和的雙抗純化兩步法工藝。尤其是對(duì)于副產(chǎn)物雜質(zhì)譜更加復(fù)雜的非對(duì)稱型雙抗分子B，意義重大。

MabSelect VL工藝優(yōu)化參考

此外，還可以通過多種策略進(jìn)一步優(yōu)化MabSelect VL對(duì)復(fù)雜抗體的純化效果：

上下游聯(lián)動(dòng)：通過分子改造^【19-22】、調(diào)整 DNA轉(zhuǎn)染比例^【2，23】以及優(yōu)化培養(yǎng)條件^【24】，盡可能放大樣品和雜質(zhì)的差異或使表達(dá)向雜質(zhì)差異最大化的方向推進(jìn)。同時(shí)注意提高分子穩(wěn)定性，減少產(chǎn)品/工藝相關(guān)雜質(zhì)^【25】。

層析工藝參數(shù)優(yōu)化：優(yōu)化淋洗和洗脫條件，篩選合適的緩沖液類型及濃度^【26】、電導(dǎo)（或轉(zhuǎn)換為低pH條件下，僅拉電導(dǎo)梯度洗脫）、pH。優(yōu)化添加劑方案包括類型及濃度，如NaCl、CaCl₂、精氨酸、硫酸銨等（注意添加劑效果和Protein A有差異且對(duì)濃度更加敏感）^{【7，9，27】}，同時(shí)考慮對(duì)HCP等雜質(zhì)的去除效果^【3，8】。注意不同工藝參數(shù)（因子）之間是否存在交互效應(yīng)。

填料篩選：雙抗/三抗等復(fù)雜抗體分子產(chǎn)生的片段雜質(zhì)、以及因錯(cuò)配或不完全組裝產(chǎn)生的其它雜質(zhì)分子，在某些亞結(jié)構(gòu)域（如VH/VL）數(shù)量上往往和目標(biāo)分子有差別，優(yōu)先選擇結(jié)合對(duì)應(yīng)區(qū)域的親和填料，而未必是Protein A，依據(jù)結(jié)合價(jià)（Valency）或/及親和力、分子量等的差異，在捕獲階段即有效地去除副產(chǎn)物雜質(zhì)，減輕精純壓力，提高整體工藝的穩(wěn)健性。

除了MabSelect VL之外，Cytiva還提供多款不同結(jié)合特性的抗體/片段親和填料，以覆蓋各種分子類型和設(shè)計(jì)，如圖8，包括：

基于Protein A改造而來的：PrismA/PrismA X（PrismA配基，結(jié)合Fc區(qū)以及增強(qiáng)結(jié)合VH3）^{【28，29】}、MabSelect VH3（僅結(jié)合VH3，F(xiàn)c區(qū)互作被敲除）^【32-33】、MabSelect SuRe（LX）/SuRe 70（SuRe配基，結(jié)合Fc區(qū)，如用于FcFc*雙抗）^{【28，30，31】}，對(duì)于低pH敏感樣品還可以選擇溫和洗脫的MabSelect mild elution（僅結(jié)合Fc區(qū)）。
基于片段親和的MabSelect VL（結(jié)合kappa輕鏈可變區(qū)）、KappaSelect（結(jié)合kappa輕鏈恒定區(qū)）^【34】和LambdaFabSelect（結(jié)合lambda輕鏈恒定區(qū)）。

其中，MabSelect VL以及MabSelect VH3在去除聚集體方面也比經(jīng)典Protein A略勝一籌，可為優(yōu)選^{【1，9，10，32，35】}；且因只結(jié)合Fab區(qū)可能體現(xiàn)出更佳分辨率^{【1，5，33】}；甚至用于homodimer等雜質(zhì)的監(jiān)測(cè)^【4，36】。

圖8：Cytiva抗體親和捕獲填料匯總

相對(duì)于在早期文獻(xiàn)中頻繁出現(xiàn)的Capto L，新一代MabSelect VL進(jìn)行了諸多優(yōu)化^【37】：

耐堿性：MabSelect VL通常耐受0.1 M NaOH CIP清洗，相對(duì)于Capto L（耐受15 mM NaOH）有顯著提升。針對(duì)實(shí)際料液，還需要考慮樣品的初始結(jié)合強(qiáng)度、蛋白酶以及fouling對(duì)載量的影響，可以根據(jù)料液性質(zhì)優(yōu)化CIP策略^{【37，38】}。

載量：針對(duì)mab、Fab、dAb測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品，MabSelect VL的載量比Capto L有近2倍的提升。對(duì)人IgG標(biāo)準(zhǔn)品的載量高達(dá) 70 mg/mL（RT=6 min），多抗工藝開發(fā)階段通常上樣30-40 mg/mL^{【1，9，27】}。

洗脫pH：可以通過篩選不同的緩沖液體系以及濃度、鹽添加劑等來優(yōu)化并提高M(jìn)abSelect VL的洗脫pH和分辨率。^{【10，26，39】}。

骨架：相對(duì)于Capto骨架，MabSelect骨架更適合抗體大分子，流速壓力性能同樣卓越。

以上，進(jìn)一步提升并拓寬了MabSelect VL在工業(yè)級(jí)抗體分子親和捕獲領(lǐng)域的應(yīng)用。

結(jié)語

綜上，面對(duì)雙抗/三抗等復(fù)雜抗體分子的純化挑戰(zhàn)，以MabSelect VL為代表的Protein L親和填料，以強(qiáng)大的抗體副產(chǎn)物雜質(zhì)及聚體去除能力，讓片段親和捕獲再次站在聚光燈下，使得雙抗/三抗等復(fù)雜分子的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)去除以及兩步法工藝更加易行，整體工藝更加穩(wěn)健，值得推廣測(cè)試。

MabSelect VL產(chǎn)品說明書

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