聚焦層析亦是一種柱層析，所以，和其他的層析相同，其亦是將緩沖交換劑作為固定相，將緩沖劑作為流動(dòng)相。能夠從聚焦效應(yīng)、蛋白質(zhì)的行為以及pH梯度溶液的形成這三方面來(lái)對(duì)聚焦層析原理進(jìn)行闡述。

1、蛋白質(zhì)的行為

層析柱中的pH值以及蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（PI）決定了蛋白質(zhì)所帶電荷。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的PI超過(guò)柱中的pH時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，并且不會(huì)結(jié)合陰離子交換劑。隨著洗脫劑向前移動(dòng)，隨著淋洗時(shí)間延長(zhǎng)，固定相中的pH值會(huì)發(fā)生變化。當(dāng)白質(zhì)移動(dòng)至環(huán)境pH高于其PI時(shí)，蛋白質(zhì)由帶正電變?yōu)閹ж?fù)電荷，并與陰離子交換劑結(jié)合。因?yàn)橥ㄟ^(guò)了洗脫劑，蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境pH 發(fā)生變化，低于PI，其又帶正電荷，并從交換劑解吸下來(lái)。隨著洗脫液向柱底的遷移，將反復(fù)進(jìn)行著上述過(guò)程，所以在各自的等電點(diǎn)洗脫下各種蛋白質(zhì)，從而使得分離的目的達(dá)到。蛋白質(zhì)不一樣，具有的等電點(diǎn)等電點(diǎn)，離子交換劑與它們結(jié)合之前，有著不同的移動(dòng)的距離，根據(jù)等電點(diǎn)排列洗脫出來(lái)的先后次序。

2、聚焦效應(yīng)

聚焦效應(yīng)是指pH梯度環(huán)境中，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行排列的過(guò)程。聚焦效應(yīng)是以pH梯度的形成為先決條件的。如果在已形成pH梯度的層析柱上加入一種蛋白質(zhì)，因?yàn)橄疵撘旱倪B續(xù)流動(dòng)，其將向著與它等電點(diǎn)相同的pH處迅速地遷移。從這個(gè)位置開(kāi)始，蛋白質(zhì)一直會(huì)通過(guò)緩慢的速度吸附、解吸附，一直到在等電點(diǎn)pH時(shí)被洗出。如果在析出此蛋白質(zhì)樣品之前，再將第二份同種蛋白質(zhì)樣品加入，那么在洗脫液的作用下，第二份同種蛋白質(zhì)樣品不被固定相吸附，會(huì)用相同的速度向前移動(dòng)，一直到遷移至近似本身等電點(diǎn)的環(huán)境處位置，之后兩份樣品以同樣的速度遷移。左后被同時(shí)從柱底洗出。實(shí)質(zhì)上，同時(shí)從柱底洗出。分次加入一種樣品時(shí)，只要還沒(méi)有洗出先加入者，并且有一定的時(shí)間進(jìn)行聚焦，那么還能夠在柱上加入剩余樣品，就能夠順利完成其聚焦過(guò)程，得到滿意的結(jié)果。

3、PH梯度溶液的形成

在離子交換層析中，依靠梯度混合儀來(lái)使得pH梯度溶液的形成實(shí)現(xiàn)。當(dāng)使用陰離子交換劑進(jìn)行層析時(shí)，將高pH溶液裝入梯度儀的混合室，而將低pH極限溶液裝入另外一個(gè)室，之后將層析柱的下端出口打開(kāi)，使得洗脫液從柱體連續(xù)不斷地流過(guò)。此時(shí)從柱的上部到下部溶液的pH值的變化就是由高到低的。當(dāng)洗脫液流進(jìn)多緩沖交換劑時(shí)，因?yàn)榫哂芯彌_能力的電荷基團(tuán)為交換劑所攜帶，因此，能夠自動(dòng)形成pH梯度。

例如，當(dāng)將作為固定相的陰離子交換劑PBE94裝入柱中時(shí)，首先使用起始緩沖液將pH值平衡到9，然后再將從柱體通過(guò)含有pH值為6的用作流動(dòng)相的多緩沖物質(zhì)的淋洗液，此刻，在堿性陰離子交換對(duì)和多緩沖劑中酸性Z強(qiáng)的組分相結(jié)合發(fā)生中和。柱內(nèi)每點(diǎn)的pH值隨著不斷加入淋洗液而逐漸下降。按照此方法處理一段時(shí)間后，pH6～9的梯度就從層析柱頂部到底部形成了。

聚焦層析柱中在淋洗過(guò)程中自動(dòng)形成了pH梯度溶液，然而隨著淋洗的進(jìn)行，pH梯度會(huì)不斷向下遷移，從底部流出液的pH由9至6Z后保持恒定，此時(shí)就不存在層析柱的pH梯度。