粘性末端克隆

使用傳統(tǒng)酶切酶連法進(jìn)行克隆時，首先需要分析酶切位點，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)只有AgeI和BstZ17I兩個酶切位點可用于EGFRvIII基因克隆，因為另外兩個酶切位點BamHI和EcoRI同時存在于EGFRvIII基因的內(nèi)部，導(dǎo)致無法使用。而P2A元件和iRFP720基因必須和EGFRvIII基因處于同一個讀碼框，又導(dǎo)致無法使用AgeI酶切位點進(jìn)行后續(xù)的克隆。針對這種酶切位點無法選擇的情況，我們可以選擇不需要考慮酶切位點的同源重組技術(shù)。

使用同源重組技術(shù)無需考慮載體的酶切位點，只需在目的片段特異性上、下游引物5’端引入與線性化載體末端同源序列（15-25bp）即可。

1.制備線性化載體：可以用PCR或酶切的方式得到線性化的pLVX-TetOne載體。（最好膠回收純化）

2.目的基因的引物設(shè)計：EGFRvIII上游引物、RFP720下游引物分別與線性化的pLVX-TetOne載體具有15-25bp的同源序列，并且EGFRvIII，P2A及iRFP720片段彼此之間也有15-25bp的同源序列。（這里要提到的是，P2A元件很短，僅有66 bp，有可能被重組酶中的外切酶徹底降解。我們可以通過兩輪PCR，在擴增iRFP720基因的上游引物的5’端引入部分P2A序列，即可獲得P2A + iRFP重組片段。對于這種目的基因過短的情況，可以采取這種方式。）

3. 目的基因的擴增：EGFRvIII，P2A及iRFP720三個基因的擴增。（最好膠回收純化）

4. 重組反應(yīng)：將EGFRvIII，P2A及iRFP720三個基因同時插入到pLVX-TetOne載體中。

5.轉(zhuǎn)化：將重組反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到克隆感受態(tài)細(xì)胞中。

6.克隆鑒定：通過菌落PCR，雙酶切或測序鑒定陽性克隆。

7. 表達(dá)：轉(zhuǎn)到表達(dá)感受態(tài)中進(jìn)行表達(dá)。實現(xiàn)Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)EGFRvIII基因，同時還能表達(dá)iRFP720基因，用于小動物活體熒光成像。