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得不到陽性克??？可能是忽視了這些細(xì)節(jié)……

來源：翌圣生物科技(上海)股份有限公司 更新時(shí)間：2024-12-25 14:37:04 閱讀量：272

 

 

過去

提起“分子克隆”或“載體構(gòu)建”這兩個詞，大家可能先想到的是傳統(tǒng)“酶切酶連法”，即用限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生黏性末端，通過堿基互補(bǔ)配對，T4 DNA Ligase連接兩個片段的克隆方法。

 

 

近年

“同源重組技術(shù)”逐漸受到科研人員的歡迎，如翌圣Hieff Clone®一步法快速克隆技術(shù)。相比之下，同源重組技術(shù)操作更加簡單，不受到酶切位點(diǎn)的限制，可一次進(jìn)行多個片段的拼接，大大的提高了克隆效率。

雖然同源重組技術(shù)操作簡單，但畢竟實(shí)驗(yàn)過程是環(huán)環(huán)相扣的，一旦某個細(xì)節(jié)處理不好，都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。為此，小編精心整理了同源重組實(shí)驗(yàn)的常見問題，并給出了可能的原因和解決方案。希望新手們在遇到類似問題時(shí)可快速判斷可能的原因，節(jié)省時(shí)間，更順利的完成實(shí)驗(yàn)。

 

 
 
克隆常見問題與解決
 
 

常見問題分類：

無克隆、假陽性、菌落PCR無條帶、酶切鑒定多條帶

 

 
無克隆

出現(xiàn)無克隆的現(xiàn)象，可能的原因主要是連接不成功或連接成功，但轉(zhuǎn)化失敗。具體原因分別如下：

1、 連接不成功

可能原因

解決方法

1）引物設(shè)計(jì)錯誤。

1）設(shè)計(jì)原則：同源臂（15-25 bp，GC含量40-60%）+酶切位點(diǎn)(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求保留或刪除)+基因特異性引物。

2）判斷方法：可用翌圣無縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件核對

2）載體與目的片段使用比例失調(diào)。

1）載體和目的片段濃度測定方法：常用吸光度法或瓊脂糖電泳法。

2）載體與目的片段添加比例：

①單片段建議：最適載體與目的片段摩爾比為1:2-1:3，載體使用量為0.03 pmol；目的片段使用量為0.06-0.09 pmol。

②多片段建議：最適DNA使用量為每片段（含線性化載體）0.03 pmol。

3）載體與目的片段不純。

1）推薦對線性化載體、PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。

2）純化產(chǎn)物建議溶解在pH8.0的ddH2O中保存。

3）若為未純化的DNA，加入總體積不超過反應(yīng)體系體積1/5。

4）操作問題或試劑盒失效。

建議做試劑盒附帶的陽性對照實(shí)驗(yàn)。判斷方法：

1）若陽性對照有克隆并檢測為陽性，則排除試劑盒問題。

2）若陽性對照無克隆，可能是操作問題或試劑盒失效，建議換其他人或換試劑盒進(jìn)行陽性對照實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定問題。

2、 連接成功，但無克隆

可能原因

解決方法

1）感受態(tài)細(xì)胞效率低，如＜ 107 cfu/μg。

建議用轉(zhuǎn)化效率＞107 cfu/μg的感受態(tài)細(xì)胞。

判斷方法：可轉(zhuǎn)化0.1ng質(zhì)粒（如PUC19），觀察克隆數(shù)，若生長大于1000個菌斑，則轉(zhuǎn)化效率大于107cfu/μg。

2）抗生素種類錯誤。

建議將未線性化載體轉(zhuǎn)化涂板。

判斷方法：若未長克隆，則可能是抗性種類錯誤或濃度過高。需檢查質(zhì)粒圖譜確認(rèn)抗性或確認(rèn)最適濃度。

 

 
假陽性

出現(xiàn)假陽性的情況，主要表現(xiàn)有兩種，克隆不含插入片段或含有錯誤的插入片段。具體原因分別如下：

1、克隆不含插入片段（空載）

可能原因

解決方法

1）載體線性化不完全。

建議將已制備的線性化的載體轉(zhuǎn)化涂板。  

判斷方法：如果長克隆較多，則表示線性化不完全。建議優(yōu)化酶切體系。

2）體系中混入了相同抗性的環(huán)狀質(zhì)粒。

1）產(chǎn)生原因：

①以反向PCR方式進(jìn)行載體線性化，殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板導(dǎo)致。

②目的基因PCR模板為與載體相同抗性的環(huán)狀質(zhì)粒，殘留環(huán)狀 質(zhì)粒模板導(dǎo)致。

2）判斷方法：將已制備的線性化載體和目的片段分別轉(zhuǎn)化涂板，如果長克隆較多，則表示有相同抗性的環(huán)狀質(zhì)?；烊搿＝ㄗhPCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用DpnI 消化模板后，再進(jìn)行膠回收純化處理或直接進(jìn)行膠回收純化處理，去除殘留的環(huán)狀模板質(zhì)粒導(dǎo)致的假陽性。

2、克隆含有錯誤的插入片段

可能原因

解決方法

1）PCR產(chǎn)物混有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。

1）可能情況：PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)有非特異條帶出現(xiàn)，未進(jìn)行膠回收純化。

2）解決方案：

①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；

②膠回收PCR產(chǎn)物；

③鑒定更多的克隆。

2）片段缺失。

1）可能情況：載體或片段有多個同源重復(fù)序列。

2）解決方案：借助網(wǎng)站或軟件進(jìn)行序列比對（如NCBI， Vector NTI等）。

 

 
菌落PCR無條帶

出現(xiàn)菌落PCR無條帶的現(xiàn)象，可能與PCR擴(kuò)增或重組連接有關(guān)，具體原因分別如下：

可能原因

解決方法

1）菌落PCR引物錯誤。

建議用載體的通用引物進(jìn)行菌檢，或至少使用一條通用引物。

2）PCR體系或程序不合適。

1）可能情況：用目的片段引物和載體通用引物擴(kuò)增都無產(chǎn)物。

2）解決方案：

①優(yōu)化PCR體系、程序；

②提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗(yàn)證；

③換酶切法鑒定克隆。

3）連接失敗。

1）判斷方法：目的引物或一端載體通用引物，另一端目的引物擴(kuò)增無條帶，但載體通用引物擴(kuò)增有條帶，且大小符合空載。2）可能原因：載體線性化不完全。建議優(yōu)化酶切體系。

 




 
酶切鑒定多條帶

 

可能原因

解決方法

重組載體上有多個相同的酶切位點(diǎn)。

1）換其他酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切鑒定。

2）更換克隆鑒定方法，如換成菌落PCR或測序鑒定。

 

以上就是翌圣生物為大家整理的同源重組的常見問題及相應(yīng)的建議，希望對大家有所幫助。如果還有其它更多關(guān)于同源重組的問題，歡迎留言或來電。如果您之前在用傳統(tǒng)酶的切酶連技術(shù)，現(xiàn)對高效的同源重組技術(shù)躍躍欲試，那趕快行動起來吧！

 

 
 
產(chǎn)品推薦
 
 

翌圣生物將提供高體驗(yàn)滿意度的產(chǎn)品解決方案作為責(zé)任，追求從實(shí)驗(yàn)操作者的視角考量產(chǎn)品性能！在此考量下，為大家推薦以下匠心出品——Hieff CloneTM克隆系列產(chǎn)品。該系列產(chǎn)品克隆效率顯著提升，可達(dá)95%以上?；谕粗亟M的方式，該系列產(chǎn)品無需考慮酶切位點(diǎn)，適用于任何載體和任意片段的連接。同時(shí)兼具連接反應(yīng)時(shí)間短（20 min）、操作簡單等優(yōu)勢。

產(chǎn)品定位

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Hieff Clone一步法克隆


產(chǎn)品優(yōu)勢
● 無需考慮酶切位點(diǎn)：不受插入片段酶切位點(diǎn)的限制，適用于任何載體；插入片段兼容粘性或平末端。

● 設(shè)計(jì)簡單：在插入片段的PCR擴(kuò)增引物5’端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可。

● 快速：50℃，20 min即可完成重組反應(yīng)?？寺￡栃月士蛇_(dá)95%以上。

● 應(yīng)用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆，也可結(jié)合Canace高保真酶，應(yīng)用于定點(diǎn)突變。

 

客戶反饋數(shù)據(jù)

高效、快速單片段連接

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注. A: 陰性對照轉(zhuǎn)化平板; B: 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板; C: 1和2分別為原始載體和線性化載體濃度檢測電泳圖; D: 目的片段的濃度檢測電泳圖; E: 目的片段的菌落PCR鑒定電泳圖; F: 1為重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖, 2為原始質(zhì)粒酶切對照圖; M: DL10000。pCAMBIA1300載體: 10217bp, 目的片段: 2352bp。

 

高效、快速多片段連接

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注. A: 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板; B: 1為載體酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖; C: 菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果, 其中1為原始質(zhì)粒對照電泳, 2-5為重組質(zhì)粒, 僅檢測867bp的一個目的片段, 6為假陽性; D: 陽性克隆測序結(jié)果; M：Marker II。pBR322載體：3996bp，目的片段：576bp+867bp+915bp+647bp。

 

發(fā)表部分文獻(xiàn)

[1]. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019.（IF 36.616）

[2]. Wang Y, Hu SB, et al. Genome-wide screening of NEAT1 regulators reveals cross-regulation between paraspeckles and mitochondria. Nat Cell Biol.2018 Oct;20(10):1145-1158.（IF 20.06）

[3]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017.（IF 37.205）

 

Hieff Clone TOPO克隆

 

產(chǎn)品優(yōu)勢

平末端和A末端PCR產(chǎn)物均可在瞬間（幾秒鐘-5分鐘）完成連接；

無需并與和熱休克，室溫5分鐘內(nèi)完成轉(zhuǎn)化；37℃ 10分鐘復(fù)蘇可以涂板；

 

客戶反饋數(shù)據(jù)

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發(fā)表部分文獻(xiàn)

[1]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017.（IF 37.205）

[2]. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16.（IF 30.41）

[3] Li X, Liu C X, Xue W, et al. Coordinated circRNA biogenesis and function with NF90/NF110 in viral infection[J]. Molecular Cell, 2017. (IF 14.7)

 

 

 
 
優(yōu)惠促銷
 
 

 

買克隆試劑盒，送感受態(tài)

現(xiàn)Yeasen基于同源重組的Hieff Clone®克隆試劑盒正在火熱促銷中，還有感受態(tài)贈送哦。轉(zhuǎn)化時(shí)感受態(tài)是決定因素，使用高效率感受態(tài)，會極大提高同源重組的成功率，能夠讓實(shí)驗(yàn)事半功倍，用過的都說好。趕快掃碼訂購吧~

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