目的：載脂蛋白AI(apolipoprotein, apoAI)與卵磷脂膽固醇脂酰基轉(zhuǎn)移酶(lecithin:cholesterol acyltransferase, LCAT)作為高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)的主要組分，在膽固醇由周圍組織向肝臟的運(yùn)輸排泄過(guò)程即膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport, RCT)過(guò)程中起關(guān)鍵作用近年研究進(jìn)一步證實(shí)，ApoAI與LCAT的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能糾正由于遺傳缺陷所致的低HDL血癥并有效抵抗高脂食物引起的致動(dòng)脈粥硬化(atherosclerosis, As)作用因此，ApoAI與LCAT已成為As基因ZL中較有希望的目的基因骨骼肌量大，血管豐富，位于體表易于操作，且能夠合成和分泌非肌性蛋白在骨骼肌外發(fā)揮作用，是基因ZL中理想的靶器官ApoAI與LCAT均屬分泌性蛋白質(zhì)，在肌細(xì)胞異源表達(dá)后應(yīng)能分泌入血，通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)RCT過(guò)程，發(fā)揮其抗As的作用基于以上原理，本研究以重組多順?lè)醋幽孓D(zhuǎn)錄病毒為載體，將人apoAI與LCAT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入培養(yǎng)的小鼠肌源性細(xì)胞中，探討其在肌源性細(xì)胞中的表達(dá)并分泌入血的可能性，為發(fā)展動(dòng)脈粥樣硬化基因ZL新方法奠定基礎(chǔ)方法：本實(shí)驗(yàn)室S次構(gòu)建成功含人apoAI cDNALCAT cDNA和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycin phosphotransferase, Neo)基因的三順?lè)醋又亟M逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLAPLEN和含LCAT cDNA和Neo基因的雙順?lè)醋又亟M逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLLEN，各基因之間以細(xì)小病毒內(nèi)部核糖體入口片段(internal ribosomal entry site, IRES)進(jìn)行連接用pLAPLEN與pLLEN等重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，經(jīng)擴(kuò)增抽提及純化后，以磷酸鈣沉淀法將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入包裝細(xì)胞GP+E-86與AM12，用G418(Geneticin)篩選及擴(kuò)增后挑選出抗性細(xì)胞克隆，通過(guò)NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行滴定以鑒定出GX產(chǎn)病毒的包裝細(xì)胞細(xì)胞株以其分泌的重組復(fù)制缺陷型病毒顆粒感染小鼠原代肌母細(xì)胞及肌源性細(xì)胞C2C12，一部分以低血清培養(yǎng)促其分化為肌管細(xì)胞，另一部分細(xì)胞以G418篩選成為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞克隆按不同時(shí)間收集無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液，以ELISA法檢測(cè)其中人apoAI的含量，以［3H］-膽固醇標(biāo)記底物的放射化學(xué)法檢測(cè)人LCAT的活性提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞的基因組DNA，以PCR法檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)移效率與整合情況同時(shí)以細(xì)胞免疫組化方法直觀檢測(cè)C2C12細(xì)胞的apoAI與LCAT的表達(dá)情況結(jié)果：以質(zhì)粒pLAPLEN和pLLEN轉(zhuǎn)導(dǎo)入包裝細(xì)胞后，經(jīng)篩選及滴定均獲得GX表達(dá)的產(chǎn)病毒細(xì)胞株，病毒滴度達(dá)105-106 cfu/mL，用以檢測(cè)病毒滴度的NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)液中亦被檢出有人apoAI與LCAT的表達(dá)轉(zhuǎn)染后的小鼠原代肌母細(xì)胞及C2C12細(xì)胞在分化為肌管細(xì)胞后仍保持異源表達(dá)人的apoAI與LCAT的能力經(jīng)G418篩選則獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的C2C12細(xì)胞株，60 d后仍能有效表達(dá)人apoAI與LCAT穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的C2C12細(xì)胞株在60 d時(shí)提取其細(xì)胞基因組DNA，PCR法檢測(cè)顯示人apoAI cDNA與IRES基因均有效整合基因組中細(xì)胞免疫組化方法檢測(cè)結(jié)果表明幾乎1**%的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的C2C12細(xì)胞于傳代后3個(gè)月仍能有效表達(dá)人apoAI與LCAT結(jié)論：以上結(jié)果充分表明，以重組多順?lè)醋幽孓D(zhuǎn)錄病毒為載體，將人apoAI與LCAT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠原代肌母細(xì)胞和肌源性細(xì)胞C2C12，均能有效表達(dá)apoAI與LCAT并分泌出細(xì)胞說(shuō)明以重組逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體經(jīng)間接體外方法(ex vivo)對(duì)肌源性細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾后再移植回骨骼肌內(nèi)可能是一種在體內(nèi)GX持久表達(dá)apoAI和LCAT從而防止和/或減輕動(dòng)脈粥樣硬化的安全和有效的方法