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2025-11-14 10:48:34美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特 CytoFLEX SRT桌面型流式細(xì)胞分選儀
果您需要簡(jiǎn)單易用的儀器來(lái)分選多個(gè)細(xì)胞群，從而獲得下游實(shí)驗(yàn)所需的目標(biāo)細(xì)胞，那么 CytoFLEX SRT桌面型流式細(xì)胞分選儀無(wú)疑是很棒的選擇，因?yàn)樗鲜挚烨也僮鞣奖恪?

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2025-01-13 17:45:14自動(dòng)細(xì)胞接種儀使用方法有哪些？
自動(dòng)細(xì)胞接種儀使用方法：提升實(shí)驗(yàn)效率與精確度 在現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是實(shí)驗(yàn)室工作的核心之一。而自動(dòng)細(xì)胞接種儀作為一種高效的實(shí)驗(yàn)工具，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，極大地提升了實(shí)驗(yàn)效率和準(zhǔn)確性。本篇文章將詳細(xì)介紹自動(dòng)細(xì)胞接種儀的使用方法、注意事項(xiàng)以及其在實(shí)際應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)，幫助廣大科研人員更好地掌握其操作技巧，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。 一、自動(dòng)細(xì)胞接種儀的基本原理 自動(dòng)細(xì)胞接種儀通過(guò)機(jī)械化、自動(dòng)化的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的接種。其原理是通過(guò)設(shè)定好細(xì)胞接種的時(shí)間、數(shù)量、培養(yǎng)皿規(guī)格等參數(shù)，儀器自動(dòng)將細(xì)胞液均勻地分配到各個(gè)培養(yǎng)皿中。這一過(guò)程不僅大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)人員的時(shí)間，還能有效避免人為操作誤差，提高細(xì)胞接種的均勻性與重復(fù)性。自動(dòng)細(xì)胞接種儀主要通過(guò)吸取細(xì)胞懸液、精確計(jì)量并將其精確分配到培養(yǎng)皿內(nèi)，確保每次接種的細(xì)胞數(shù)目和分布更加均勻。 二、自動(dòng)細(xì)胞接種儀的使用步驟 準(zhǔn)備工作 在使用自動(dòng)細(xì)胞接種儀之前，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)首先準(zhǔn)備好所需的培養(yǎng)皿、細(xì)胞懸液和培養(yǎng)基。確保儀器的各個(gè)部件清潔，避免交叉污染。還需檢查儀器的設(shè)置，確認(rèn)設(shè)備已連接電源并啟動(dòng)。 設(shè)置參數(shù) 自動(dòng)細(xì)胞接種儀的操作界面一般為觸摸屏，用戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置細(xì)胞接種的相關(guān)參數(shù)。這些參數(shù)包括每個(gè)培養(yǎng)皿中的接種細(xì)胞數(shù)、接種的細(xì)胞量（通常以細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞密度為單位）、每次接種的時(shí)間間隔等。 接種操作 設(shè)置完參數(shù)后，啟動(dòng)儀器進(jìn)行接種操作。儀器會(huì)自動(dòng)吸取細(xì)胞懸液，通過(guò)設(shè)定的吸管或分配裝置，將細(xì)胞均勻接種到各個(gè)培養(yǎng)皿中。在整個(gè)過(guò)程中，儀器會(huì)實(shí)時(shí)監(jiān)控接種的進(jìn)度，并根據(jù)設(shè)置的程序進(jìn)行調(diào)整。 結(jié)束與清潔 接種完成后，儀器會(huì)發(fā)出提示音，通知用戶操作結(jié)束。接著，用戶可以取出已接種的培養(yǎng)皿，放入適宜的培養(yǎng)環(huán)境中進(jìn)行孵育。儀器的各個(gè)部分需要按照規(guī)定進(jìn)行清潔和消毒，以避免細(xì)胞殘留物的堆積。 三、自動(dòng)細(xì)胞接種儀的優(yōu)勢(shì) 提高實(shí)驗(yàn)效率 自動(dòng)細(xì)胞接種儀能顯著減少人工操作時(shí)間，提高工作效率。尤其是在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，儀器能夠快速、地完成接種任務(wù)，節(jié)省大量的人工成本。 減少人為誤差 人為操作往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞接種不均勻或細(xì)胞數(shù)量偏差。使用自動(dòng)細(xì)胞接種儀后，接種過(guò)程可以嚴(yán)格按照設(shè)定的參數(shù)進(jìn)行，減少了操作中的不確定性和誤差，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。 提高接種精度 自動(dòng)細(xì)胞接種儀能夠精確控制細(xì)胞接種的數(shù)量和分布，尤其適用于需要高度精確的實(shí)驗(yàn)，如高通量篩選、藥物測(cè)試等領(lǐng)域。儀器的高精度控制確保每個(gè)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞數(shù)目均勻，避免了因細(xì)胞數(shù)量不一致而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的情況。 四、使用自動(dòng)細(xì)胞接種儀的注意事項(xiàng) 定期保養(yǎng)與維護(hù) 自動(dòng)細(xì)胞接種儀的長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行需要定期進(jìn)行維護(hù)。用戶應(yīng)根據(jù)設(shè)備手冊(cè)的要求，對(duì)儀器進(jìn)行定期清潔、校準(zhǔn)和檢修，確保儀器的性與穩(wěn)定性。 注意環(huán)境控制 盡管自動(dòng)細(xì)胞接種儀可以減少人為因素的干擾，但細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的控制依然至關(guān)重要。接種前，應(yīng)確保培養(yǎng)環(huán)境無(wú)污染，接種后及時(shí)將培養(yǎng)皿放入適宜的溫度、濕度和二氧化碳濃度環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。 操作人員培訓(xùn) 盡管自動(dòng)細(xì)胞接種儀具有較高的自動(dòng)化程度，但操作人員仍需接受專業(yè)培訓(xùn)，熟悉儀器的操作流程、參數(shù)設(shè)置及注意事項(xiàng)，以確保設(shè)備的高效運(yùn)轉(zhuǎn)和實(shí)驗(yàn)的成功。 結(jié)語(yǔ) 自動(dòng)細(xì)胞接種儀為現(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)提供了、高效的解決方案，已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究以及藥物開發(fā)中的重要工具。通過(guò)合理的參數(shù)設(shè)置和正確的操作方法，科研人員能夠更好地提升實(shí)驗(yàn)的效率與精度。掌握其使用方法，不僅能降低人工操作的風(fēng)險(xiǎn)，還能為細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)更加可控和可靠的結(jié)果。
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2022-03-01 10:17:17新品搶先試 用 | 納米磁珠細(xì)胞分選 ，Get最方便的細(xì)胞分選方法！
提到細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)，大家首先想到就是流式細(xì)胞分選，該方法使用熒光抗體標(biāo)記單細(xì)胞懸液，再通過(guò)調(diào)節(jié)合適的電壓、補(bǔ)償?shù)?，可以將目的?xì)胞與非目的細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。由于可以對(duì)多參數(shù)、不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞進(jìn)行鑒定、分類、定量和分離，流式分選技術(shù)在同時(shí)進(jìn)行多標(biāo)記的細(xì)胞分選時(shí)，其地位無(wú)可替代。但是當(dāng)需要快速獲得某種分選后的細(xì)胞時(shí)，流式分選的操作較為復(fù)雜，且花費(fèi)的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的刺激也比較大。因此，使用免疫納米磁珠進(jìn)行快速細(xì)胞分選的方法應(yīng)運(yùn)而生，該方法不僅對(duì)細(xì)胞刺激性小、速度快，而且操作簡(jiǎn)單，稍等片刻就可快速獲得目的細(xì)胞。（▲瑞沃德細(xì)胞分選新品）新品來(lái)襲，自主研發(fā)瑞沃德細(xì)胞分選產(chǎn)品包括自主研發(fā)的磁珠分選試劑盒和細(xì)胞分選柱，能在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)簡(jiǎn)單、快速的操作分選得到高純度、高活率的目標(biāo)細(xì)胞。使用流程同時(shí)，納米級(jí)別磁珠無(wú)需洗脫，分選得到的細(xì)胞可直接應(yīng)用于流式分析、細(xì)胞培養(yǎng)、單細(xì)胞測(cè)序等下游實(shí)驗(yàn)。結(jié)果展示純度*注：小鼠脾 臟細(xì)胞樣本CD3分選后純度流式檢測(cè)結(jié)果，A為分選后陰性管（流出組分），B為分選后陽(yáng)性管（滯留組分）。Marker激活情況注：小鼠脾 臟細(xì)胞樣本CD3分選后激活Marker CD69檢測(cè)結(jié)果，A為分選后Day0檢測(cè)結(jié)果，B為分選后用CD3/CD28單抗激活Day3檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用場(chǎng)景多，助力科學(xué)研究免疫學(xué)研究腫瘤學(xué)研究神經(jīng)生物學(xué)研究干細(xì)胞研究細(xì)胞治療四大特點(diǎn)，輕松獲取目標(biāo)細(xì)胞1、可獲得高純度，高活率，高得率的目的細(xì)胞2、獲得細(xì)胞可直接用于細(xì)胞培養(yǎng)，測(cè)序等下游實(shí)驗(yàn)3、溫和，低刺激，不改變細(xì)胞原本生物學(xué)特性4、高效便捷，操作簡(jiǎn)單新品上市開啟免費(fèi)試 用活動(dòng)小鼠CD3+/ CD4+/ CD8+三種細(xì)胞分選試劑盒按需任選，助您更好地細(xì)胞分選識(shí)別下方二維碼，快來(lái)申請(qǐng)免費(fèi)試 用
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2023-08-18 11:00:43如何分辨“真“、”假”全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀？
  //  上一篇《給大家推薦一種細(xì)胞計(jì)數(shù)儀性能檢測(cè)的方法》中，我們發(fā)現(xiàn)全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞樣品的重復(fù)性和梯度稀釋的結(jié)果準(zhǔn)確性上，都比半自動(dòng)插板式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀更有優(yōu)勢(shì)。那么大家可能會(huì)問(wèn)：“導(dǎo)致這樣的性能差異原因是什么呢？另外，目前市場(chǎng)上都自詡所賣的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是全自動(dòng)的，那我們?nèi)绾螀^(qū)分哪個(gè)是‘真’，哪個(gè)又是‘假’的呢？”要回答這2個(gè)問(wèn)題，首先我們需要對(duì)圖像法細(xì)胞計(jì)數(shù)的過(guò)程做下回顧。下面是圖像法臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析的基本流程。01細(xì)胞吹打混懸后定量吸取樣品02等體積吸取臺(tái)盼藍(lán)吹打染色03染色好的細(xì)胞加到血球計(jì)數(shù)板或細(xì)胞計(jì)數(shù)板上04顯微鏡下手動(dòng)或自動(dòng)統(tǒng)計(jì)死活細(xì)胞數(shù)，然后計(jì)算活細(xì)胞密度和活率05清洗血球計(jì)數(shù)板或更換新的細(xì)胞計(jì)數(shù)板傳統(tǒng)顯微鏡下手工細(xì)胞計(jì)數(shù)，以上5步操作都要操作人員來(lái)完成。這種方法因?yàn)槿藶椴僮鲙?lái)的誤差，導(dǎo)致結(jié)果差異有時(shí)會(huì)很大，甚至超出通常可以接受的±10%偏差范圍。并且隨著樣品數(shù)越多，操作人員會(huì)逐漸造成眼疲勞，無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行有效并準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)。手工顯微鏡法細(xì)胞計(jì)數(shù)的照片和計(jì)算方法插板式半自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的出現(xiàn)，省去了操作人員肉眼統(tǒng)計(jì)和分析死活細(xì)胞數(shù)的步驟，儀器操作只需要將樣品混勻、定量染色和上樣分析（有時(shí)要手動(dòng)對(duì)焦），測(cè)試結(jié)束后更換新的細(xì)胞計(jì)數(shù)板做下一個(gè)樣品。用于半自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的各類細(xì)胞計(jì)數(shù)板移液槍加樣的照片半自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的缺點(diǎn)在于：由于每塊細(xì)胞計(jì)數(shù)板的檢測(cè)樣品數(shù)量有限，所以檢測(cè)新的樣品需要更換新的板子。但板子批次間存在差異，樣品和臺(tái)盼藍(lán)體積需要手動(dòng)定量，取樣量少代表性差（從30-50mL樣品中一般就只吸取20uL樣品），染色后的細(xì)胞樣品通過(guò)移液槍加樣有時(shí)還產(chǎn)生氣泡而報(bào)廢，用后廢棄的細(xì)胞計(jì)數(shù)板會(huì)產(chǎn)生二次污染物，這些目前都還沒(méi)有好的處理方法。那有沒(méi)可能細(xì)胞的混勻和染色，以及細(xì)胞的計(jì)數(shù)和分析過(guò)程全部實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，同時(shí)不用手動(dòng)更換新的細(xì)胞計(jì)數(shù)板而自動(dòng)做下一個(gè)樣品呢？答案是使用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀。全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀相比半自動(dòng)插板式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的優(yōu)勢(shì)點(diǎn)小結(jié)：01全自動(dòng)吹打混懸和臺(tái)盼藍(lán)染色全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的一個(gè)顯著特點(diǎn)是：能夠自動(dòng)完成細(xì)胞的吹打混懸和臺(tái)盼藍(lán)染色。要實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)吸取等體積的細(xì)胞樣品和臺(tái)盼藍(lán)染料，首先需要由儀器內(nèi)部的步進(jìn)馬達(dá)精確地完成加樣體積的控制。其次，因?yàn)榭梢匀詣?dòng)吸取樣品，所以全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀會(huì)有1個(gè)轉(zhuǎn)盤或孔板放置其他待測(cè)樣品。對(duì)于排在后面的細(xì)胞若發(fā)生沉降，就需要在測(cè)試前對(duì)樣品進(jìn)行吹打混懸，以防止細(xì)胞沉降導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果出現(xiàn)偏差。而這2步操作，半自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀都只能通過(guò)手動(dòng)來(lái)完成，從而引入人為操作誤差。同時(shí)，Vi-CELL BLU全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀單個(gè)樣品檢測(cè)的取樣體積200±20uL，加樣體積不需要很準(zhǔn)確，儀器自動(dòng)會(huì)完成定量取樣。相比半自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀只有10-50uL的取樣體積，而且由手動(dòng)操作完成。取樣體積大代表性更好，測(cè)試結(jié)果更容易接近真實(shí)值。02動(dòng)態(tài)百圖分析Vi-CELL BLU全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)試細(xì)胞樣品，單個(gè)樣品拍攝的照片達(dá)到了100張，分析的細(xì)胞數(shù)量更多，1x10e6個(gè)/mL的細(xì)胞懸液拍攝100張照片的細(xì)胞數(shù)差不多2600個(gè)。單個(gè)樣品檢測(cè)拍攝的細(xì)胞數(shù)越多，檢測(cè)結(jié)果的系統(tǒng)誤差越小，測(cè)試結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性也相應(yīng)更高。其中1張照片（上左圖）和100張照片的分析柱狀圖03高通量和不間斷檢測(cè)全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的另一個(gè)特點(diǎn)是高通量和不間斷檢測(cè)，即待測(cè)樣品可以先放到轉(zhuǎn)盤或96孔板上，根據(jù)軟件中設(shè)置好的分析條件，儀器會(huì)自動(dòng)按要求完成細(xì)胞的計(jì)數(shù)和活率分析。Vi-CELL BLU全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀一次最多可以放21個(gè)樣品（使用24位轉(zhuǎn)盤）或96個(gè)樣品（使用96孔板）進(jìn)行分析測(cè)試。若使用24位轉(zhuǎn)盤，在檢測(cè)過(guò)程中還可以實(shí)現(xiàn)不間斷上樣測(cè)試，即樣品測(cè)試過(guò)程中，還可以放入新的待測(cè)樣品。綜上所述，全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在細(xì)胞樣品混懸和染色方面避免了人為操作帶來(lái)的誤差，同時(shí)百圖分析拍攝的細(xì)胞數(shù)多，結(jié)果代表性更好。所以，在細(xì)胞計(jì)數(shù)方面重復(fù)性和準(zhǔn)確性上相比半自動(dòng)插板式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀更有優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的高通量和不間斷檢測(cè)功能，又滿足實(shí)驗(yàn)室樣品量大，不同老師共用該儀器的檢測(cè)需求。并且每個(gè)樣品測(cè)試結(jié)束后，儀器會(huì)自動(dòng)進(jìn)行管路清洗，儀器本身還帶有自動(dòng)過(guò)夜清洗功能，使得儀器一直處于待機(jī)狀態(tài)。所以，在操作便捷性上，全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀也勝過(guò)半自動(dòng)插板式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。以上這些特點(diǎn)可以用于區(qū)分我們使用的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是“全自動(dòng)”還是“半自動(dòng)”，同時(shí)也是為何全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀性能上要優(yōu)于半自動(dòng)的地方。希望大家可以通過(guò)這些方法來(lái)分辨“真”、“假”全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。
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2023-06-09 11:41:52人人都是流式高手：Tumor-infiltrating lymphocytes(TILs) 分選秘籍
Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) 是指浸潤(rùn)腫瘤組織的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，負(fù)責(zé)識(shí)別和攻擊異常細(xì)胞，包括癌細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)TILs的分選提供了一個(gè)重要的工具，用于表征、純化和研究浸潤(rùn)腫瘤的免疫細(xì)胞群。它有助于研究人員了解TILs的組成、功能和潛在的治 療相關(guān)性，推動(dòng)我們對(duì)腫瘤與免疫相互作用的理解。我們使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分選TILs主要應(yīng)用場(chǎng)景如下：01、鑒定和表征：流式細(xì)胞術(shù)允許我們根據(jù)TILs表面標(biāo)記物的特征來(lái)鑒定和表征不同的亞群。通過(guò)使用針對(duì)CD3、CD4、CD8和其他免疫細(xì)胞標(biāo)記物的特異性抗體來(lái)標(biāo)記細(xì)胞，我們可以區(qū)分和定量TILs中的各種T細(xì)胞亞群。這有助于我們了解腫瘤微環(huán)境中TILs的組成和多樣性。02、特定TIL亞群的純化：流式細(xì)胞術(shù)分選使我們能夠分離和純化感興趣的特定TIL亞群。通過(guò)基于表面標(biāo)記物的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選和篩選，我們可以收集純凈的TIL亞群用于進(jìn)一步的下游應(yīng)用。這使研究人員能夠研究特定的TIL亞群，并研究其功能特性或基因表達(dá)譜。03、功能分析：分選后的TILs可用于功能性分析，以評(píng)估其免疫活性和功能。例如，可以測(cè)試分選后的TILs的增殖能力、細(xì)胞因子產(chǎn)生、對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性或其他功能性實(shí)驗(yàn)。這些分析提供了有關(guān)TIL亞群功能能力和潛在抗腫瘤免疫反應(yīng)的見解。04、基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析：流式細(xì)胞術(shù)分選可以獲得純凈的TIL細(xì)胞群，進(jìn)而進(jìn)行基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過(guò)分析分選TILs的基因表達(dá)或蛋白質(zhì)譜，研究人員可以更深入地了解與TILs在腫瘤免疫中相關(guān)的分子機(jī)制和信號(hào)通路。然而不同于外周血、脾 臟中的淋巴細(xì)胞，TILs的流式檢測(cè)存在更多的不確定性，需要有效優(yōu)化包括樣本處理、配色方案、上樣條件以及分析方法等實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的各個(gè)方面，才能實(shí)現(xiàn)更為準(zhǔn)確、真實(shí)的多色復(fù)雜樣本流式檢測(cè)。圖1為外周血來(lái)源樣本淋巴細(xì)胞分型的流式檢測(cè)數(shù)據(jù)，由圖可見，淋巴細(xì)胞群體T、B細(xì)胞分群明顯，T細(xì)胞亞群也可清晰區(qū)分。另外，我們也可以看到，該數(shù)據(jù)以FSC通道設(shè)定閾值，其閾值設(shè)定值較低，導(dǎo)致碎片及噪音信號(hào)干擾明顯，不過(guò)由于血液樣本碎片較少，與細(xì)胞分群明顯，故而對(duì)最 終結(jié)果的影響并不大。圖1 血液樣本淋巴細(xì)胞免疫分型流式數(shù)據(jù)然而，當(dāng)我們使用同樣的模板檢測(cè)腫瘤組織樣本時(shí)，數(shù)據(jù)就出現(xiàn)了明顯問(wèn)題。實(shí)體瘤組織細(xì)胞構(gòu)成復(fù)雜，并且在將組織樣本制備成單細(xì)胞樣本的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的細(xì)胞碎片，這些雜質(zhì)細(xì)胞及碎片會(huì)對(duì)流式檢測(cè)造成顯著的干擾。如圖2所示，T細(xì)胞中出現(xiàn)了大量CD19和CD3雙陽(yáng)性細(xì)胞，不符合已有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果。這些雙陽(yáng)性細(xì)胞主要是由于雜質(zhì)細(xì)胞及碎片的非特異干擾導(dǎo)致的。這些干擾對(duì)于流式檢測(cè)及流式分選的準(zhǔn)確性有很大影響，甚至?xí)?dǎo)致得出錯(cuò)誤的結(jié)論。圖2 浸潤(rùn)腫瘤組織的淋巴細(xì)胞免疫分型流式數(shù)據(jù)那么，基于以上數(shù)據(jù)，我們應(yīng)該如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以提高浸潤(rùn)腫瘤組織的淋巴細(xì)胞分選的準(zhǔn)確性呢？這里給大家以下幾點(diǎn)建議：01、增加Pan-Marker檢測(cè)：這里的Pan-Marker是指目標(biāo)細(xì)胞群均表達(dá)，但其他細(xì)胞群體及碎片不表達(dá)的表面標(biāo)記。CD45廣泛表達(dá)于免疫系統(tǒng)的各個(gè)細(xì)胞亞群上，但在非免疫細(xì)胞上沒(méi)有表達(dá)或表達(dá)很低。因此，在檢測(cè)淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞時(shí)，可通過(guò)檢測(cè)CD45是否表達(dá)來(lái)區(qū)分免疫細(xì)胞及非免疫細(xì)胞，以達(dá)到排除雜質(zhì)細(xì)胞干擾的目的。02、優(yōu)化樣本制備方案：對(duì)復(fù)雜樣本來(lái)講，樣本制備方案是否合適決定了流式實(shí)驗(yàn)的成功率。可根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇最 佳的消化酶配方和消化時(shí)間，在確保細(xì)胞得率的同時(shí)盡量減少雜質(zhì)干擾并最 大限度的保存細(xì)胞活性及功能。此外，選擇合適的細(xì)胞分離手段進(jìn)行目的細(xì)胞的富集。例如，若針對(duì)淋巴細(xì)胞檢測(cè)，利用Ficoll或Percoll密度梯度離心法富集單個(gè)核細(xì)胞，可有效去除脂肪、碎片及雜質(zhì)細(xì)胞的干擾。03、進(jìn)行Fc封閉：組織浸潤(rùn)的多種細(xì)胞，特別是單核/巨噬細(xì)胞以及DC細(xì)胞高表達(dá)抗體Fc端的受體。這些細(xì)胞在進(jìn)行流式抗體標(biāo)記時(shí)，即使不表達(dá)相關(guān)抗原，也可通過(guò)Fc受體非特異性的結(jié)合流式抗體的Fc端，從而導(dǎo)致非特異信號(hào)。要解決這一問(wèn)題，可購(gòu)買商業(yè)化Fc封閉試劑，在標(biāo)記流式抗體前進(jìn)行Fc封閉即可。04、合理設(shè)定閾值：閾值的設(shè)定與實(shí)驗(yàn)?zāi)康南⑾⑾嚓P(guān)。在流式分析實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)當(dāng)設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號(hào)，僅保留少量碎片信號(hào)即可。在流式分選實(shí)驗(yàn)中，若分選所得細(xì)胞用于培養(yǎng)，同樣應(yīng)當(dāng)設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號(hào)，僅保留少量碎片信號(hào)，這樣做可以有效提高分選效率及回收率；但若分選所得細(xì)胞用于qPCR、測(cè)序，特別是單細(xì)胞測(cè)序等基因組學(xué)應(yīng)用，由于碎片中含有一定量的核酸片段乃至細(xì)胞核碎片，在分選過(guò)程中就需要將盡可能多的碎片與目的細(xì)胞區(qū)分，因此應(yīng)當(dāng)設(shè)定較低的閾值以暴露足量的碎片信號(hào)讓分選儀器檢測(cè)到，進(jìn)而有效確保分選所得目的細(xì)胞不摻雜核酸碎片，以免影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。05、利用空白熒光通道排除非特異：什么是空白熒光通道呢?舉一個(gè)例子，我們?cè)O(shè)計(jì)一個(gè)3色實(shí)驗(yàn)標(biāo)記FITC、PE、PE-Cy7三種染料，沒(méi)有標(biāo)記APC，在檢測(cè)時(shí)APC通道就是空白通道，是不應(yīng)該有陽(yáng)性信號(hào)的。復(fù)雜樣本中的部分雜質(zhì)細(xì)胞有較強(qiáng)的非特異熒光信號(hào)，通常這些非特異的熒光信號(hào)在所有的流式熒光通道中均可檢測(cè)到?；谶@一原理，我們可在上樣時(shí)預(yù)留一到兩個(gè)空白熒光通道，樣本中的目的細(xì)胞沒(méi)有標(biāo)記這些空通道的熒光素，在這些通道里面是陰性的，而雜質(zhì)細(xì)胞的非特異信號(hào)在空白通道中通常也是陽(yáng)性的，我們就可以通過(guò)設(shè)門選擇空白通道中的陰性細(xì)胞來(lái)達(dá)到去除非特異信號(hào)的目的。需要注意的是，利用這一方法時(shí)要充分考慮補(bǔ)償?shù)挠绊?，?好選擇與已用通道補(bǔ)償小或無(wú)補(bǔ)償?shù)耐ǖ雷鳛榭瞻淄ǖ馈?6、增加細(xì)胞死活染料：死細(xì)胞的非特異性地結(jié)合會(huì)增加假陽(yáng)性。死細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光干擾特定信號(hào)的檢測(cè)。在TILs分選中去除死細(xì)胞?？梢栽黾訑?shù)據(jù)準(zhǔn)確性：死亡的細(xì)胞可能會(huì)釋放細(xì)胞碎片和細(xì)胞內(nèi)成分，這可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，引入假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。通過(guò)去除死細(xì)胞，可以提高分選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。并且為分選后TILs細(xì)胞活力提供保證：分選到活細(xì)胞可以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的有效性和可靠性。死亡細(xì)胞不具備正常的生物活性和功能，因此分選到活細(xì)胞可以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从痴鎸?shí)的細(xì)胞生物學(xué)狀態(tài)。圖3 無(wú)死細(xì)胞排除處理的樣本分析比較圖4 有死細(xì)胞排除處理的樣本分析比較復(fù)蘇后的PBMC在免疫染色之前不添加（圖 3）或者添加ViaKrome 405可固定活性染料（55℃，10分鐘）（圖 4）。然后，使用Perfix-nc細(xì)胞染色試劑盒（型號(hào) B10825）處理細(xì)胞，并用Granzyme B-FITC、CD19-PE、CD14-ECD、CD79a-PC5.5、CD3-PC7 和 CD45- Krome Orange 進(jìn)行染色。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)信息顯示：兩個(gè)不同條件下，門內(nèi)細(xì)胞在上一門級(jí)百分比也不一樣，充分展示了消除死細(xì)胞以后的數(shù)據(jù)效果。
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2023-07-03 11:42:58人人都是流式高手：GFP分選，這還有我不會(huì)的？
很常見的場(chǎng)景如下：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，想用流式檢測(cè)表達(dá)GFP細(xì)胞的百分比并且分選，但是不同的設(shè)門方法讓GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比看起來(lái)有差異，究竟下面哪種策略才適合呢？今天我們主要討論一下FSC和SSC上設(shè)門對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比的影響。讓我們一個(gè)一個(gè)設(shè)門，把每種情況具體看一下。保持FITC通道上的門不變，我們來(lái)看一下在前向和側(cè)向的散點(diǎn)圖上設(shè)門在不同的位置，代表你選擇了什么類型的細(xì)胞。只有P1賦予了藍(lán)色，其他門的顏色去掉，這樣，我們就可以很方便的看出來(lái)細(xì)胞群在不同的圖上所處的位置。第 一種設(shè)門，除了左下角靠近0的碎片不圈，其他基本都圈上，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點(diǎn)圖可以看出來(lái)有單個(gè)細(xì)胞也有粘連細(xì)胞，P2門下 GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比為61.36%。第二種設(shè)門，只圈最密集的這一群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點(diǎn)圖可以看出來(lái)，這部分的細(xì)胞基本都是單個(gè)的，P2門下 GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比為65.39%，較第 一種高。第三種設(shè)門，密集細(xì)胞群左邊的和左下角靠近0的碎片不圈，只圈右邊的這兩群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點(diǎn)圖可以看出來(lái)有單個(gè)細(xì)胞也有粘連細(xì)胞，P2門下 GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比為65.70%，較第 一種高，和第二種差不多，但是稍微高一點(diǎn)。這樣分析下來(lái)，大家最 大的困惑是這三群細(xì)胞要不要圈，怎么圈才是最 好的？讓我們?cè)诘?一張F(tuán)SC和SSC的散點(diǎn)圖上根據(jù)細(xì)胞群設(shè)三個(gè)門。三個(gè)門分別為P1、P4和P5，顯示了三種不同的細(xì)胞群。P1顯示為單個(gè)細(xì)胞，F(xiàn)ITC通道上陽(yáng)性細(xì)胞比例為65.54%。P4顯示大部分為粘連的細(xì)胞，因此在FITC通道上的陽(yáng)性細(xì)胞比例為71.43%，較P1細(xì)胞群高，如果分析時(shí)加入這群細(xì)胞會(huì)增加GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。如果在單克隆分選中選擇這群，會(huì)導(dǎo)致雖然篩選到陽(yáng)性細(xì)胞，但是單克隆源性降低。P5顯示為單個(gè)細(xì)胞，但是因?yàn)镕SC較P1小，考慮是細(xì)胞狀態(tài)不好細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮導(dǎo)致，所以其在FITC通道上的陽(yáng)性細(xì)胞比例為20.15%，較P1細(xì)胞群低的多，如果分析時(shí)加入這群細(xì)胞則會(huì)降低GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。如果加入7AAD染料，這群會(huì)呈現(xiàn)出陽(yáng)性，所以在分選中這群細(xì)胞不該圈選，或者在去除死細(xì)胞的門中去除。由此可見，如果只想要分析狀態(tài)好的單個(gè)細(xì)胞的GFP陽(yáng)性百分比，那你可以選擇P1門的設(shè)門方式，當(dāng)然也可以把P1和P4都選上，再用SSC-A和SSC-H去掉粘連細(xì)胞對(duì)數(shù)據(jù)的干擾。練習(xí)題如果您在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，流式檢測(cè)表達(dá)mCherry細(xì)胞的百分比時(shí)發(fā)現(xiàn)，mCherry通道細(xì)胞群并沒(méi)有呈現(xiàn)明顯分開的兩群（由于細(xì)胞在mCherry通道有較高的自發(fā)熒光），要怎么確定mCherry細(xì)胞百分比并且分選呢？
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