很常見的場景如下：

細胞轉(zhuǎn)染后，想用流式檢測表達GFP細胞的百分比并且分選，但是不同的設(shè)門方法讓GFP陽性細胞百分比看起來有差異，究竟下面哪種策略才適合呢？

今天我們主要討論一下FSC和SSC上設(shè)門對GFP陽性細胞百分比的影響。讓我們一個一個設(shè)門，把每種情況具體看一下。

保持FITC通道上的門不變，我們來看一下在前向和側(cè)向的散點圖上設(shè)門在不同的位置，代表你選擇了什么類型的細胞。只有P1賦予了藍色，其他門的顏色去掉，這樣，我們就可以很方便的看出來細胞群在不同的圖上所處的位置。

第 一種設(shè)門，除了左下角靠近0的碎片不圈，其他基本都圈上，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點圖可以看出來有單個細胞也有粘連細胞，P2門下 GFP陽性細胞百分比為61.36%。

第二種設(shè)門，只圈最密集的這一群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點圖可以看出來，這部分的細胞基本都是單個的，P2門下 GFP陽性細胞百分比為65.39%，較第 一種高。

第三種設(shè)門，密集細胞群左邊的和左下角靠近0的碎片不圈，只圈右邊的這兩群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點圖可以看出來有單個細胞也有粘連細胞，P2門下 GFP陽性細胞百分比為65.70%，較第 一種高，和第二種差不多，但是稍微高一點。

這樣分析下來，大家最 大的困惑是這三群細胞要不要圈，怎么圈才是最 好的？讓我們在第 一張FSC和SSC的散點圖上根據(jù)細胞群設(shè)三個門。

三個門分別為P1、P4和P5，顯示了三種不同的細胞群。

P1顯示為單個細胞，F(xiàn)ITC通道上陽性細胞比例為65.54%。

P4顯示大部分為粘連的細胞，因此在FITC通道上的陽性細胞比例為71.43%，較P1細胞群高，如果分析時加入這群細胞會增加GFP陽性細胞百分比。如果在單克隆分選中選擇這群，會導(dǎo)致雖然篩選到陽性細胞，但是單克隆源性降低。

P5顯示為單個細胞，但是因為FSC較P1小，考慮是細胞狀態(tài)不好細胞呈現(xiàn)皺縮導(dǎo)致，所以其在FITC通道上的陽性細胞比例為20.15%，較P1細胞群低的多，如果分析時加入這群細胞則會降低GFP陽性細胞百分比。如果加入7AAD染料，這群會呈現(xiàn)出陽性，所以在分選中這群細胞不該圈選，或者在去除死細胞的門中去除。

由此可見，如果只想要分析狀態(tài)好的單個細胞的GFP陽性百分比，那你可以選擇P1門的設(shè)門方式，當(dāng)然也可以把P1和P4都選上，再用SSC-A和SSC-H去掉粘連細胞對數(shù)據(jù)的干擾。

練習(xí)題

如果您在細胞轉(zhuǎn)染后，流式檢測表達mCherry細胞的百分比時發(fā)現(xiàn)，mCherry通道細胞群并沒有呈現(xiàn)明顯分開的兩群（由于細胞在mCherry通道有較高的自發(fā)熒光），要怎么確定mCherry細胞百分比并且分選呢？

Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) 是指浸潤腫瘤組織的淋巴細胞。淋巴細胞是免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，負(fù)責(zé)識別和攻擊異常細胞，包括癌細胞。

流式細胞術(shù)對TILs的分選提供了一個重要的工具，用于表征、純化和研究浸潤腫瘤的免疫細胞群。它有助于研究人員了解TILs的組成、功能和潛在的治 療相關(guān)性，推動我們對腫瘤與免疫相互作用的理解。

我們使用流式細胞術(shù)來分選TILs主要應(yīng)用場景如下：

01、鑒定和表征：

流式細胞術(shù)允許我們根據(jù)TILs表面標(biāo)記物的特征來鑒定和表征不同的亞群。通過使用針對CD3、CD4、CD8和其他免疫細胞標(biāo)記物的特異性抗體來標(biāo)記細胞，我們可以區(qū)分和定量TILs中的各種T細胞亞群。這有助于我們了解腫瘤微環(huán)境中TILs的組成和多樣性。

02、特定TIL亞群的純化：

流式細胞術(shù)分選使我們能夠分離和純化感興趣的特定TIL亞群。通過基于表面標(biāo)記物的表達，對細胞進行分選和篩選，我們可以收集純凈的TIL亞群用于進一步的下游應(yīng)用。這使研究人員能夠研究特定的TIL亞群，并研究其功能特性或基因表達譜。

03、功能分析：

分選后的TILs可用于功能性分析，以評估其免疫活性和功能。例如，可以測試分選后的TILs的增殖能力、細胞因子產(chǎn)生、對腫瘤細胞的細胞毒性或其他功能性實驗。這些分析提供了有關(guān)TIL亞群功能能力和潛在抗腫瘤免疫反應(yīng)的見解。

04、基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析：

流式細胞術(shù)分選可以獲得純凈的TIL細胞群，進而進行基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過分析分選TILs的基因表達或蛋白質(zhì)譜，研究人員可以更深入地了解與TILs在腫瘤免疫中相關(guān)的分子機制和信號通路。

然而不同于外周血、脾 臟中的淋巴細胞，TILs的流式檢測存在更多的不確定性，需要有效優(yōu)化包括樣本處理、配色方案、上樣條件以及分析方法等實驗設(shè)計的各個方面，才能實現(xiàn)更為準(zhǔn)確、真實的多色復(fù)雜樣本流式檢測。

圖1為外周血來源樣本淋巴細胞分型的流式檢測數(shù)據(jù)，由圖可見，淋巴細胞群體T、B細胞分群明顯，T細胞亞群也可清晰區(qū)分。另外，我們也可以看到，該數(shù)據(jù)以FSC通道設(shè)定閾值，其閾值設(shè)定值較低，導(dǎo)致碎片及噪音信號干擾明顯，不過由于血液樣本碎片較少，與細胞分群明顯，故而對最 終結(jié)果的影響并不大。

圖1 血液樣本淋巴細胞免疫分型流式數(shù)據(jù)

然而，當(dāng)我們使用同樣的模板檢測腫瘤組織樣本時，數(shù)據(jù)就出現(xiàn)了明顯問題。實體瘤組織細胞構(gòu)成復(fù)雜，并且在將組織樣本制備成單細胞樣本的過程中會產(chǎn)生大量的細胞碎片，這些雜質(zhì)細胞及碎片會對流式檢測造成顯著的干擾。如圖2所示，T細胞中出現(xiàn)了大量CD19和CD3雙陽性細胞，不符合已有文獻報道的結(jié)果。這些雙陽性細胞主要是由于雜質(zhì)細胞及碎片的非特異干擾導(dǎo)致的。這些干擾對于流式檢測及流式分選的準(zhǔn)確性有很大影響，甚至?xí)?dǎo)致得出錯誤的結(jié)論。

圖2 浸潤腫瘤組織的淋巴細胞免疫分型流式數(shù)據(jù)

那么，基于以上數(shù)據(jù)，我們應(yīng)該如何優(yōu)化實驗設(shè)計以提高浸潤腫瘤組織的淋巴細胞分選的準(zhǔn)確性呢？這里給大家以下幾點建議：

01、增加Pan-Marker檢測：

這里的Pan-Marker是指目標(biāo)細胞群均表達，但其他細胞群體及碎片不表達的表面標(biāo)記。CD45廣泛表達于免疫系統(tǒng)的各個細胞亞群上，但在非免疫細胞上沒有表達或表達很低。因此，在檢測淋巴細胞等免疫細胞時，可通過檢測CD45是否表達來區(qū)分免疫細胞及非免疫細胞，以達到排除雜質(zhì)細胞干擾的目的。

02、優(yōu)化樣本制備方案：

對復(fù)雜樣本來講，樣本制備方案是否合適決定了流式實驗的成功率?？筛鶕?jù)文獻報道并通過預(yù)實驗來選擇最 佳的消化酶配方和消化時間，在確保細胞得率的同時盡量減少雜質(zhì)干擾并最 大限度的保存細胞活性及功能。此外，選擇合適的細胞分離手段進行目的細胞的富集。例如，若針對淋巴細胞檢測，利用Ficoll或Percoll密度梯度離心法富集單個核細胞，可有效去除脂肪、碎片及雜質(zhì)細胞的干擾。

03、進行Fc封閉：

組織浸潤的多種細胞，特別是單核/巨噬細胞以及DC細胞高表達抗體Fc端的受體。這些細胞在進行流式抗體標(biāo)記時，即使不表達相關(guān)抗原，也可通過Fc受體非特異性的結(jié)合流式抗體的Fc端，從而導(dǎo)致非特異信號。要解決這一問題，可購買商業(yè)化Fc封閉試劑，在標(biāo)記流式抗體前進行Fc封閉即可。

04、合理設(shè)定閾值：

閾值的設(shè)定與實驗?zāi)康南⑾⑾嚓P(guān)。在流式分析實驗中，應(yīng)當(dāng)設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號，僅保留少量碎片信號即可。在流式分選實驗中，若分選所得細胞用于培養(yǎng)，同樣應(yīng)當(dāng)設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號，僅保留少量碎片信號，這樣做可以有效提高分選效率及回收率；但若分選所得細胞用于qPCR、測序，特別是單細胞測序等基因組學(xué)應(yīng)用，由于碎片中含有一定量的核酸片段乃至細胞核碎片，在分選過程中就需要將盡可能多的碎片與目的細胞區(qū)分，因此應(yīng)當(dāng)設(shè)定較低的閾值以暴露足量的碎片信號讓分選儀器檢測到，進而有效確保分選所得目的細胞不摻雜核酸碎片，以免影響后續(xù)實驗準(zhǔn)確性。

05、利用空白熒光通道排除非特異：

什么是空白熒光通道呢?舉一個例子，我們設(shè)計一個3色實驗標(biāo)記FITC、PE、PE-Cy7三種染料，沒有標(biāo)記APC，在檢測時APC通道就是空白通道，是不應(yīng)該有陽性信號的。復(fù)雜樣本中的部分雜質(zhì)細胞有較強的非特異熒光信號，通常這些非特異的熒光信號在所有的流式熒光通道中均可檢測到?；谶@一原理，我們可在上樣時預(yù)留一到兩個空白熒光通道，樣本中的目的細胞沒有標(biāo)記這些空通道的熒光素，在這些通道里面是陰性的，而雜質(zhì)細胞的非特異信號在空白通道中通常也是陽性的，我們就可以通過設(shè)門選擇空白通道中的陰性細胞來達到去除非特異信號的目的。需要注意的是，利用這一方法時要充分考慮補償?shù)挠绊?，?好選擇與已用通道補償小或無補償?shù)耐ǖ雷鳛榭瞻淄ǖ馈?/p>

06、增加細胞死活染料：

死細胞的非特異性地結(jié)合會增加假陽性。死細胞會產(chǎn)生自發(fā)熒光干擾特定信號的檢測。在TILs分選中去除死細胞。可以增加數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性：死亡的細胞可能會釋放細胞碎片和細胞內(nèi)成分，這可能會干擾實驗結(jié)果，引入假陽性或假陰性結(jié)果。通過去除死細胞，可以提高分選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。并且為分選后TILs細胞活力提供保證：分選到活細胞可以保證后續(xù)實驗的有效性和可靠性。死亡細胞不具備正常的生物活性和功能，因此分選到活細胞可以確保后續(xù)實驗?zāi)軌蚍从痴鎸嵉募毎飳W(xué)狀態(tài)。

圖3 無死細胞排除處理的樣本分析比較

圖4 有死細胞排除處理的樣本分析比較

復(fù)蘇后的PBMC在免疫染色之前不添加（圖 3）或者添加ViaKrome 405可固定活性染料（55℃，10分鐘）（圖 4）。然后，使用Perfix-nc細胞染色試劑盒（型號 B10825）處理細胞，并用Granzyme B-FITC、CD19-PE、CD14-ECD、CD79a-PC5.5、CD3-PC7 和 CD45- Krome Orange 進行染色。 

數(shù)據(jù)統(tǒng)計信息顯示：兩個不同條件下，門內(nèi)細胞在上一門級百分比也不一樣，充分展示了消除死細胞以后的數(shù)據(jù)效果。

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讓我們先來“康康”其中兩個吧~

小技巧1：

對于單克隆的孔板分選，可以適當(dāng)稀釋樣本。放慢進樣流速。得到活率更好的單細胞。對于細胞團塊：在樣本里加入適當(dāng)?shù)腅DTA和DNAase來防止。對于極脆弱的細胞分選：可以讓儀器運行時的進樣壓差控制在0.5以內(nèi)。

小技巧2：

在細胞制備、培養(yǎng)階段，如果該培養(yǎng)細胞是貼壁細胞，需用先用胰酶消化細胞，然后收集待測樣品細胞，離心、洗滌、封閉后標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體即可。

還有很多非常實用的小技巧

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11月25日，貝克曼庫爾特第十五屆流式分選全國用戶會在合肥成功舉行，100多位專家與學(xué)者相約合肥，共赴每年的約定。

疫情讓大家的距離變遠了，由于出行限制很多專家未能親臨現(xiàn)場。疫情也讓大家的距離變近了，大家通過線下與線下結(jié)合的方式，仍然愉快的在學(xué)術(shù)的海洋中暢游。

會議中讓我們對腫瘤微環(huán)境與母胎免疫中的機制有了更深的了解。

而隨著科技的進步，納微米醫(yī)藥劑型也在生物藥領(lǐng)域嶄露頭角，而流式細胞儀的發(fā)展讓小顆粒檢測獲得了新的方法學(xué)平臺，更多讓人興奮的實驗結(jié)果也逐漸增加。

而在細胞治 療領(lǐng)域，NK細胞治 療，干細胞治 療領(lǐng)域，專家進行了系統(tǒng)的梳理。也讓大家見證了行業(yè)發(fā)展之快，以及臨床轉(zhuǎn)化研究帶來的希望。

榮獲科學(xué)家的選擇，“最 佳生命科學(xué)新產(chǎn)品獎”的CytoFLEX SRT讓大家從容分選，專心科學(xué)本身，而不再花太多精力在儀器操作。

希望2023年我們繼續(xù)我們一年一次的約會。沒有到現(xiàn)場的朋友可以點擊下面視頻感受來自現(xiàn)場的熱情。

一提到金相鑲嵌，很多人腦海中就會浮現(xiàn)出諸多的品牌，有國產(chǎn)的，有進口的，有快速的，有慢速的，有熱鑲嵌的，還有冷鑲嵌。其實用過MetLab金相鑲嵌機就知道，時至今日，此款美國原裝進口金相鑲嵌機不但性價比高，還可以輕松快速完成樣品鑲嵌，是金相熱鑲嵌的理想設(shè)備，你不會還不知道吧??？

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    原裝進口美國MetLab雙筒全自動熱壓鑲嵌機METPRESS-2：雙筒可同時作業(yè)，可同時鑲嵌4個試樣，全程只需8min，可編程，尤其適合重復(fù)制樣。體積小，占用空間小，防腐不銹鋼結(jié)構(gòu)，電動液壓，無需氣源，快速、安全、耐用，故障率低，運行、維護成本低，是大批量金相試樣熱鑲嵌的理想設(shè)備。

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