Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) 是指浸潤腫瘤組織的淋巴細胞。淋巴細胞是免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，負責識別和攻擊異常細胞，包括癌細胞。

流式細胞術(shù)對TILs的分選提供了一個重要的工具，用于表征、純化和研究浸潤腫瘤的免疫細胞群。它有助于研究人員了解TILs的組成、功能和潛在的治 療相關(guān)性，推動我們對腫瘤與免疫相互作用的理解。

我們使用流式細胞術(shù)來分選TILs主要應(yīng)用場景如下：

01、鑒定和表征：

流式細胞術(shù)允許我們根據(jù)TILs表面標記物的特征來鑒定和表征不同的亞群。通過使用針對CD3、CD4、CD8和其他免疫細胞標記物的特異性抗體來標記細胞，我們可以區(qū)分和定量TILs中的各種T細胞亞群。這有助于我們了解腫瘤微環(huán)境中TILs的組成和多樣性。

02、特定TIL亞群的純化：

流式細胞術(shù)分選使我們能夠分離和純化感興趣的特定TIL亞群。通過基于表面標記物的表達，對細胞進行分選和篩選，我們可以收集純凈的TIL亞群用于進一步的下游應(yīng)用。這使研究人員能夠研究特定的TIL亞群，并研究其功能特性或基因表達譜。

03、功能分析：

分選后的TILs可用于功能性分析，以評估其免疫活性和功能。例如，可以測試分選后的TILs的增殖能力、細胞因子產(chǎn)生、對腫瘤細胞的細胞毒性或其他功能性實驗。這些分析提供了有關(guān)TIL亞群功能能力和潛在抗腫瘤免疫反應(yīng)的見解。

04、基因組學或蛋白質(zhì)組學分析：

流式細胞術(shù)分選可以獲得純凈的TIL細胞群，進而進行基因組學或蛋白質(zhì)組學分析。通過分析分選TILs的基因表達或蛋白質(zhì)譜，研究人員可以更深入地了解與TILs在腫瘤免疫中相關(guān)的分子機制和信號通路。

然而不同于外周血、脾 臟中的淋巴細胞，TILs的流式檢測存在更多的不確定性，需要有效優(yōu)化包括樣本處理、配色方案、上樣條件以及分析方法等實驗設(shè)計的各個方面，才能實現(xiàn)更為準確、真實的多色復(fù)雜樣本流式檢測。

圖1為外周血來源樣本淋巴細胞分型的流式檢測數(shù)據(jù)，由圖可見，淋巴細胞群體T、B細胞分群明顯，T細胞亞群也可清晰區(qū)分。另外，我們也可以看到，該數(shù)據(jù)以FSC通道設(shè)定閾值，其閾值設(shè)定值較低，導(dǎo)致碎片及噪音信號干擾明顯，不過由于血液樣本碎片較少，與細胞分群明顯，故而對最 終結(jié)果的影響并不大。

圖1 血液樣本淋巴細胞免疫分型流式數(shù)據(jù)

然而，當我們使用同樣的模板檢測腫瘤組織樣本時，數(shù)據(jù)就出現(xiàn)了明顯問題。實體瘤組織細胞構(gòu)成復(fù)雜，并且在將組織樣本制備成單細胞樣本的過程中會產(chǎn)生大量的細胞碎片，這些雜質(zhì)細胞及碎片會對流式檢測造成顯著的干擾。如圖2所示，T細胞中出現(xiàn)了大量CD19和CD3雙陽性細胞，不符合已有文獻報道的結(jié)果。這些雙陽性細胞主要是由于雜質(zhì)細胞及碎片的非特異干擾導(dǎo)致的。這些干擾對于流式檢測及流式分選的準確性有很大影響，甚至會導(dǎo)致得出錯誤的結(jié)論。

圖2 浸潤腫瘤組織的淋巴細胞免疫分型流式數(shù)據(jù)

那么，基于以上數(shù)據(jù)，我們應(yīng)該如何優(yōu)化實驗設(shè)計以提高浸潤腫瘤組織的淋巴細胞分選的準確性呢？這里給大家以下幾點建議：

01、增加Pan-Marker檢測：

這里的Pan-Marker是指目標細胞群均表達，但其他細胞群體及碎片不表達的表面標記。CD45廣泛表達于免疫系統(tǒng)的各個細胞亞群上，但在非免疫細胞上沒有表達或表達很低。因此，在檢測淋巴細胞等免疫細胞時，可通過檢測CD45是否表達來區(qū)分免疫細胞及非免疫細胞，以達到排除雜質(zhì)細胞干擾的目的。

02、優(yōu)化樣本制備方案：

對復(fù)雜樣本來講，樣本制備方案是否合適決定了流式實驗的成功率?？筛鶕?jù)文獻報道并通過預(yù)實驗來選擇最 佳的消化酶配方和消化時間，在確保細胞得率的同時盡量減少雜質(zhì)干擾并最 大限度的保存細胞活性及功能。此外，選擇合適的細胞分離手段進行目的細胞的富集。例如，若針對淋巴細胞檢測，利用Ficoll或Percoll密度梯度離心法富集單個核細胞，可有效去除脂肪、碎片及雜質(zhì)細胞的干擾。

03、進行Fc封閉：

組織浸潤的多種細胞，特別是單核/巨噬細胞以及DC細胞高表達抗體Fc端的受體。這些細胞在進行流式抗體標記時，即使不表達相關(guān)抗原，也可通過Fc受體非特異性的結(jié)合流式抗體的Fc端，從而導(dǎo)致非特異信號。要解決這一問題，可購買商業(yè)化Fc封閉試劑，在標記流式抗體前進行Fc封閉即可。

04、合理設(shè)定閾值：

閾值的設(shè)定與實驗?zāi)康南⑾⑾嚓P(guān)。在流式分析實驗中，應(yīng)當設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號，僅保留少量碎片信號即可。在流式分選實驗中，若分選所得細胞用于培養(yǎng)，同樣應(yīng)當設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號，僅保留少量碎片信號，這樣做可以有效提高分選效率及回收率；但若分選所得細胞用于qPCR、測序，特別是單細胞測序等基因組學應(yīng)用，由于碎片中含有一定量的核酸片段乃至細胞核碎片，在分選過程中就需要將盡可能多的碎片與目的細胞區(qū)分，因此應(yīng)當設(shè)定較低的閾值以暴露足量的碎片信號讓分選儀器檢測到，進而有效確保分選所得目的細胞不摻雜核酸碎片，以免影響后續(xù)實驗準確性。

05、利用空白熒光通道排除非特異：

什么是空白熒光通道呢?舉一個例子，我們設(shè)計一個3色實驗標記FITC、PE、PE-Cy7三種染料，沒有標記APC，在檢測時APC通道就是空白通道，是不應(yīng)該有陽性信號的。復(fù)雜樣本中的部分雜質(zhì)細胞有較強的非特異熒光信號，通常這些非特異的熒光信號在所有的流式熒光通道中均可檢測到?；谶@一原理，我們可在上樣時預(yù)留一到兩個空白熒光通道，樣本中的目的細胞沒有標記這些空通道的熒光素，在這些通道里面是陰性的，而雜質(zhì)細胞的非特異信號在空白通道中通常也是陽性的，我們就可以通過設(shè)門選擇空白通道中的陰性細胞來達到去除非特異信號的目的。需要注意的是，利用這一方法時要充分考慮補償?shù)挠绊?，?好選擇與已用通道補償小或無補償?shù)耐ǖ雷鳛榭瞻淄ǖ馈?/p>

06、增加細胞死活染料：

死細胞的非特異性地結(jié)合會增加假陽性。死細胞會產(chǎn)生自發(fā)熒光干擾特定信號的檢測。在TILs分選中去除死細胞?？梢栽黾訑?shù)據(jù)準確性：死亡的細胞可能會釋放細胞碎片和細胞內(nèi)成分，這可能會干擾實驗結(jié)果，引入假陽性或假陰性結(jié)果。通過去除死細胞，可以提高分選結(jié)果的準確性和可靠性。并且為分選后TILs細胞活力提供保證：分選到活細胞可以保證后續(xù)實驗的有效性和可靠性。死亡細胞不具備正常的生物活性和功能，因此分選到活細胞可以確保后續(xù)實驗?zāi)軌蚍从痴鎸嵉募毎飳W狀態(tài)。

圖3 無死細胞排除處理的樣本分析比較

圖4 有死細胞排除處理的樣本分析比較

復(fù)蘇后的PBMC在免疫染色之前不添加（圖 3）或者添加ViaKrome 405可固定活性染料（55℃，10分鐘）（圖 4）。然后，使用Perfix-nc細胞染色試劑盒（型號 B10825）處理細胞，并用Granzyme B-FITC、CD19-PE、CD14-ECD、CD79a-PC5.5、CD3-PC7 和 CD45- Krome Orange 進行染色。 

數(shù)據(jù)統(tǒng)計信息顯示：兩個不同條件下，門內(nèi)細胞在上一門級百分比也不一樣，充分展示了消除死細胞以后的數(shù)據(jù)效果。

很常見的場景如下：

細胞轉(zhuǎn)染后，想用流式檢測表達GFP細胞的百分比并且分選，但是不同的設(shè)門方法讓GFP陽性細胞百分比看起來有差異，究竟下面哪種策略才適合呢？

今天我們主要討論一下FSC和SSC上設(shè)門對GFP陽性細胞百分比的影響。讓我們一個一個設(shè)門，把每種情況具體看一下。

保持FITC通道上的門不變，我們來看一下在前向和側(cè)向的散點圖上設(shè)門在不同的位置，代表你選擇了什么類型的細胞。只有P1賦予了藍色，其他門的顏色去掉，這樣，我們就可以很方便的看出來細胞群在不同的圖上所處的位置。

第 一種設(shè)門，除了左下角靠近0的碎片不圈，其他基本都圈上，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點圖可以看出來有單個細胞也有粘連細胞，P2門下 GFP陽性細胞百分比為61.36%。

第二種設(shè)門，只圈最密集的這一群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點圖可以看出來，這部分的細胞基本都是單個的，P2門下 GFP陽性細胞百分比為65.39%，較第 一種高。

第三種設(shè)門，密集細胞群左邊的和左下角靠近0的碎片不圈，只圈右邊的這兩群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點圖可以看出來有單個細胞也有粘連細胞，P2門下 GFP陽性細胞百分比為65.70%，較第 一種高，和第二種差不多，但是稍微高一點。

這樣分析下來，大家最 大的困惑是這三群細胞要不要圈，怎么圈才是最 好的？讓我們在第 一張FSC和SSC的散點圖上根據(jù)細胞群設(shè)三個門。

三個門分別為P1、P4和P5，顯示了三種不同的細胞群。

P1顯示為單個細胞，F(xiàn)ITC通道上陽性細胞比例為65.54%。

P4顯示大部分為粘連的細胞，因此在FITC通道上的陽性細胞比例為71.43%，較P1細胞群高，如果分析時加入這群細胞會增加GFP陽性細胞百分比。如果在單克隆分選中選擇這群，會導(dǎo)致雖然篩選到陽性細胞，但是單克隆源性降低。

P5顯示為單個細胞，但是因為FSC較P1小，考慮是細胞狀態(tài)不好細胞呈現(xiàn)皺縮導(dǎo)致，所以其在FITC通道上的陽性細胞比例為20.15%，較P1細胞群低的多，如果分析時加入這群細胞則會降低GFP陽性細胞百分比。如果加入7AAD染料，這群會呈現(xiàn)出陽性，所以在分選中這群細胞不該圈選，或者在去除死細胞的門中去除。

由此可見，如果只想要分析狀態(tài)好的單個細胞的GFP陽性百分比，那你可以選擇P1門的設(shè)門方式，當然也可以把P1和P4都選上，再用SSC-A和SSC-H去掉粘連細胞對數(shù)據(jù)的干擾。

練習題

如果您在細胞轉(zhuǎn)染后，流式檢測表達mCherry細胞的百分比時發(fā)現(xiàn)，mCherry通道細胞群并沒有呈現(xiàn)明顯分開的兩群（由于細胞在mCherry通道有較高的自發(fā)熒光），要怎么確定mCherry細胞百分比并且分選呢？

為期10天的流式分選小技巧征集已經(jīng)結(jié)束啦，大家對流式分選都有很多心得哦。經(jīng)過5位貝克曼應(yīng)用和市場專家的評選，有11位小伙伴的作品入圍本輪大眾投票。

讓我們先來“康康”其中兩個吧~

小技巧1：

對于單克隆的孔板分選，可以適當稀釋樣本。放慢進樣流速。得到活率更好的單細胞。對于細胞團塊：在樣本里加入適當?shù)腅DTA和DNAase來防止。對于極脆弱的細胞分選：可以讓儀器運行時的進樣壓差控制在0.5以內(nèi)。

小技巧2：

在細胞制備、培養(yǎng)階段，如果該培養(yǎng)細胞是貼壁細胞，需用先用胰酶消化細胞，然后收集待測樣品細胞，離心、洗滌、封閉后標記熒光素偶聯(lián)抗體即可。

還有很多非常實用的小技巧

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11月25日，貝克曼庫爾特第十五屆流式分選全國用戶會在合肥成功舉行，100多位專家與學者相約合肥，共赴每年的約定。

疫情讓大家的距離變遠了，由于出行限制很多專家未能親臨現(xiàn)場。疫情也讓大家的距離變近了，大家通過線下與線下結(jié)合的方式，仍然愉快的在學術(shù)的海洋中暢游。

會議中讓我們對腫瘤微環(huán)境與母胎免疫中的機制有了更深的了解。

而隨著科技的進步，納微米醫(yī)藥劑型也在生物藥領(lǐng)域嶄露頭角，而流式細胞儀的發(fā)展讓小顆粒檢測獲得了新的方法學平臺，更多讓人興奮的實驗結(jié)果也逐漸增加。

而在細胞治 療領(lǐng)域，NK細胞治 療，干細胞治 療領(lǐng)域，專家進行了系統(tǒng)的梳理。也讓大家見證了行業(yè)發(fā)展之快，以及臨床轉(zhuǎn)化研究帶來的希望。

榮獲科學家的選擇，“最 佳生命科學新產(chǎn)品獎”的CytoFLEX SRT讓大家從容分選，專心科學本身，而不再花太多精力在儀器操作。

希望2023年我們繼續(xù)我們一年一次的約會。沒有到現(xiàn)場的朋友可以點擊下面視頻感受來自現(xiàn)場的熱情。

2023年6月迎來了全國第22個“安全生產(chǎn)月”活動，國務(wù)委員會應(yīng)急管理部門發(fā)布了主題為“人人講安全，個個會應(yīng)急”的活動主題。

為了配合大家的安全宣講工作，本期為您分享機械生產(chǎn)中安全的定義與要求、安全評估方法、及如何達到安全要求等的專業(yè)知識，并為您送上一本全面的機械安全防護技術(shù)資料。

一、什么是風險與安全？

風險和安全的準確定義是什么？國際標準 ISO/IEC 指南 51 給出了以下定義。

二、機械安全的準分類

A類標準：本標準為基本安全標準，包括適用于各種產(chǎn)品和系統(tǒng)的一般安全相關(guān)的基本概念、原則和要求

B類標準：本標準為成組安全標準，包括適用于幾種產(chǎn)品或系統(tǒng)，或者類似系列產(chǎn)品或系統(tǒng)，且盡可能參照基本

安全標準的安全要求。

C類標準：本標準為產(chǎn)品安全標準，包括適用于特定產(chǎn)品或系統(tǒng)，或者系列產(chǎn)品或系統(tǒng)，且盡可能參照基本安全標準和成組安全標準。

三、如何進行風險評估

ISO 12100確定了如下的風險評價流程

關(guān)于3步法的介紹：

3步法是由機械設(shè)計者來進行的安全防護方法，其分別的內(nèi)容是：

第 一步：考慮“本質(zhì)上的”安全設(shè)計措施

本質(zhì)安全設(shè)計措施，源自 ISO 12100:2010以下定義適用。

防護措施 - 通過改變機器設(shè)計或操作特性而無需采取防護措施或采用保護裝置消除危險或降低與危險相關(guān)風險

第二步：安全防護和補充性防護措施

安全防護，源自 ISO 12100:2010以下定義適用。

防護措施 - 使用安全裝置保護人員免除無法合理消除的危險或安全設(shè)計措施不足以降低的風險

補充防護措施，源自 ISO 12100:2010

既非本質(zhì)安全設(shè)計措施、也非安全防護（防護裝置和 / 或保護裝置的落實） 或使用信息，應(yīng)按機器預(yù)期用途和合理可預(yù)見的誤用要求來實施。

第三步：使用信息

使用信息，源自 ISO 12100:2010以下定義適用。

防護措施 - 包括單獨或組合使用的通信鏈路（如文本、文字、標志、信號、符號、圖表等），以便向用戶傳送信息

那么，關(guān)于安全等級PL的性能等級如何定義與判斷？在考慮補充性防護措施的時候，如何選擇與安裝才能達到安全等級？